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《河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》2009年02期
【作者單位】：河北師范大學(xué)體育學(xué)院
收稿日期：2008-10-15
基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(30700390)；河北師范大學(xué)博士基金(L2005828)
【摘要】：
線粒體呼吸鏈?zhǔn)沁\(yùn)動(dòng)內(nèi)源性活性氧(ROS)產(chǎn)生的主要來源，內(nèi)源性ROS產(chǎn)生增多，可導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸等物質(zhì)的氧化損傷。研究表明，ROS產(chǎn)生可引起質(zhì)子漏，質(zhì)子漏增加可降低ROS生成，提示ROS與質(zhì)子漏之間存在一種反饋回路；解偶聯(lián)蛋白(UCPs)參與了這種反饋調(diào)節(jié)，但其確切分子機(jī)制尚不清楚。從運(yùn)動(dòng)中線粒體ROS產(chǎn)生及其機(jī)制等方面進(jìn)行了綜述。
機(jī)體在有氧代謝過程中會(huì)產(chǎn)生一類具有較活潑化學(xué)性質(zhì)的含氧自由基及其衍生物———活性氧(reactive oxygen species，ROS)，這類物質(zhì)包括超氧陰離子(O2·-)、單線態(tài)氧(1-O2)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、脂質(zhì)過氧自由基(LOO·)等。在正常情況下，機(jī)體內(nèi)ROS產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡。研究表明，急性劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體內(nèi)清除ROS的能力不足以平衡運(yùn)動(dòng)應(yīng)激情況下產(chǎn)生的ROS時(shí)，可引起運(yùn)動(dòng)性內(nèi)源ROS產(chǎn)生增多，導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸等物質(zhì)的氧化損傷。線粒體是運(yùn)動(dòng)中能量供應(yīng)的“動(dòng)力工廠”，也是運(yùn)動(dòng)中內(nèi)源性ROS產(chǎn)生的主要部位。本文中，筆者從線粒體ROS產(chǎn)生部位及調(diào)節(jié)機(jī)制等方面進(jìn)行了綜述。
1運(yùn)動(dòng)中活性氧產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)研究
1．1運(yùn)動(dòng)中活性氧產(chǎn)生的直接證據(jù)
1982年，Davies等初次應(yīng)用電子自旋共振技術(shù)(electron spin resonance，ESR)直接證實(shí)了力竭運(yùn)動(dòng)后肝臟、肌肉中自由基明顯增多的現(xiàn)象，從而找到了運(yùn)動(dòng)誘發(fā)ROS生成增多直接的證據(jù)。隨后，陳英杰等也應(yīng)用ESR技術(shù)觀察到運(yùn)動(dòng)后骨骼肌中自由基信號(hào)增加。隨著研究方法和儀器的更新，近年來的研究也為運(yùn)動(dòng)中ROS產(chǎn)生的機(jī)理提供了直接證據(jù)。cArdle等通過培養(yǎng)H-2kb肌細(xì)胞(一種骨骼肌成肌細(xì)胞，來源于tsA58型鼠)，用還原型二氯熒光素(DCFH)探針直接測定H-2kb細(xì)胞在電刺激前、中、后ROS的產(chǎn)生，研究表明，在安靜時(shí)DCFH的氧化速率未發(fā)生變化，而在持續(xù)10min的電刺激后，DCFH的氧化速率增加了4倍，且刺激結(jié)束后仍然保持較高的速率；研究還表明，當(dāng)給予過氧化物清除劑1，2-二羥基苯-3，5-二磺酸鈉(Tiron)時(shí)，可減少DCFH氧化生成的H2O2。Bejma等以青年和老年鼠在一次力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌ROS的產(chǎn)生的研究也表明，劇烈運(yùn)動(dòng)使青年鼠DCFH氧化速率增加了38％，老年鼠增加了50％。張勇等采用遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)研究表明，急性運(yùn)動(dòng)中骨骼肌線粒體中ROS生成呈先上升后下降的變化趨勢，其中運(yùn)動(dòng)至45、90、120min時(shí)均較安靜時(shí)顯著升高，于120min達(dá)到峰值，隨后150min時(shí)顯著降低。潘紅英等以電刺激C2C12細(xì)胞使其產(chǎn)生收縮運(yùn)動(dòng)為模型，DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的時(shí)相變化，研究表明，在刺激60min時(shí)ROS的生成速率顯著升高，然后緩慢下降，繼續(xù)刺激到120min時(shí)，ROS生成再次升高，隨后迅速下降。上述研究采用不同的方法手段直接測定了細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，為進(jìn)一步研究運(yùn)動(dòng)中ROS產(chǎn)生在生理學(xué)和病理學(xué)中的生物意義提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；但采用ESR技術(shù)需要熟練的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和昂貴的儀器，而細(xì)胞內(nèi)植熒光探針在實(shí)驗(yàn)過程中易受外界因素的影響，因此，需要進(jìn)一步探索研究一種準(zhǔn)確、簡便、經(jīng)濟(jì)的方法測定內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生，為后續(xù)的科學(xué)研究提供方法學(xué)基礎(chǔ)。
1．2運(yùn)動(dòng)中活性氧產(chǎn)生的間接證據(jù)
大量研究表明，在進(jìn)行一次急性有氧運(yùn)動(dòng)時(shí)，隨著耗氧量的激增，內(nèi)源性ROS大量生成，導(dǎo)致機(jī)體氧應(yīng)激加強(qiáng)，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA等氧化損傷和機(jī)體抗氧化能力下降等，由于ROS的壽命短難以檢測，因此，在研究中常用這些氧化底物的終產(chǎn)物或副產(chǎn)品來間接反映ROS產(chǎn)生及其對(duì)機(jī)體造成的危害程度，包括丙二醛(MDA)，蛋白質(zhì)羰基含量(protein carbonyl，PC)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)，總抗氧化能力(T-AOC)等指標(biāo)，1978年，Dillard等初次報(bào)道人以50％至大攝氧量負(fù)荷踏車運(yùn)動(dòng)1 h后，呼出氣中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物戊烷含量明顯增加。隨后，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究，Bejma等研究表明，劇烈運(yùn)動(dòng)后骨骼肌脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA增加了20％，氧化型谷胱苷肽(GSSG)的含量增加、GSH/GSSG比值降低。張?zhí)N琨等研究表明，在力竭游泳運(yùn)動(dòng)后，小鼠骨骼肌、肝臟中MDA含量顯著上升，血清CK、LDH活性顯著升高，SOD呈下降趨勢。徐冬青等觀察力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌形態(tài)學(xué)改變與自由基損傷的關(guān)系，結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)后即刻骨骼肌MDA水平更高，運(yùn)動(dòng)后24h骨骼肌MDA仍維持較高水平，48h后骨骼肌MDA呈明顯下降趨勢，但仍高于對(duì)照組。Bachur等以三級(jí)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷不同持續(xù)時(shí)間為運(yùn)動(dòng)模型觀察大鼠骨骼肌中MDA、GSH、VE的變化，結(jié)果表明，與安靜對(duì)照組相比，隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加和持續(xù)時(shí)間的延長，大鼠骨骼肌MDA水平逐漸增加，GSH、VE濃度在不同負(fù)荷下降低程度不同，在小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中以GSH降低為主，隨負(fù)荷增加VE濃度逐漸降低。另外，大量研究表明，補(bǔ)充抗氧化劑可提高機(jī)體清除ROS的能力，降低氧化應(yīng)激引起的損傷。You等報(bào)道大鼠補(bǔ)充VC+VE 2周后，下坡跑，運(yùn)動(dòng)后2h比目魚肌、股中肌及血漿中PC濃度顯著低于對(duì)照組。Li等以過度運(yùn)動(dòng)損傷模型觀察補(bǔ)充Cu/Zn-SOD對(duì)骨骼肌氧化損傷影響的研究表明，補(bǔ)充Cu/Zn-SOD組在第3、7d血漿SOD、GSH-Px總抗氧化能力(T-AOC)與對(duì)照組相比顯著升高，MDA、CK的含量顯著降低。
另有研究表明，由運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激產(chǎn)物無顯著性變化。Hoffman等研究不同強(qiáng)度下骨骼肌的過氧化反應(yīng)，以11名男子運(yùn)動(dòng)員為研究對(duì)象，在60％和90％至大負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度下進(jìn)行4組蹲舉練習(xí)，結(jié)果顯示在2種強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)中血漿MDA濃度無顯著性變化，研究認(rèn)為MDA濃度的變化獨(dú)立于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。造成這種差異的原因可能與研究對(duì)象、運(yùn)動(dòng)方式等不同有關(guān)?？傊毙赃\(yùn)動(dòng)引起的ROS大量生成，機(jī)體抗氧化能力下降，導(dǎo)致組織氧化應(yīng)激加強(qiáng)，其代謝終產(chǎn)物或副產(chǎn)物增多，已被大量實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。
2運(yùn)動(dòng)中活性氧產(chǎn)生的機(jī)制研究
2．1線粒體呼吸鏈?zhǔn)腔钚匝醍a(chǎn)生的重要來源
在機(jī)體物質(zhì)和能量代謝過程中，能源物質(zhì)經(jīng)各自代謝途徑進(jìn)入線粒體，經(jīng)三羧酸循環(huán)逐步脫氫，終在線粒體呼吸鏈通過各種酶和輔酶的催化下與氧分子結(jié)合生成水，同時(shí)在此過程中偶聯(lián)著能量的生成與利用、轉(zhuǎn)移。Indo等以魚藤酮、3-硝基丙酸、抗霉素A、氰化鈉等物質(zhì)抑制線粒體呼吸鏈研究表明，當(dāng)呼吸鏈抑制時(shí)ROS大量生成。Schonfeld等研究表明，在順呼吸鏈條件下，ROS產(chǎn)生增加與呼吸鏈電子傳遞抑制呈線性關(guān)系，復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ等部位是線粒體內(nèi)源性產(chǎn)生的主要部位。St-Pierre等通過加入不同底物和抑制劑來測定大鼠骨骼肌、心肌、肝臟線粒體中ROS的產(chǎn)生，研究顯示，加入棕櫚酸肉堿時(shí)骨骼肌、心肌線粒體中有過氧化物大量生成；當(dāng)用魚藤酮(一種呼吸鏈抑制劑)抑制復(fù)合物Ⅰ時(shí)，發(fā)現(xiàn)過氧化物大量生成，提示復(fù)合物Ⅰ是ROS產(chǎn)生的部位之一。另有研究認(rèn)為，CoQ是線粒體呼吸鏈重要組成部分，也是ROS產(chǎn)生的主要部位之一，電子經(jīng)CoQ傳遞時(shí)會(huì)引起半醌(QH·)的產(chǎn)生，QH·可與氧分子作用生成O2·-。進(jìn)行運(yùn)動(dòng)時(shí)線粒體QH·轉(zhuǎn)運(yùn)速率大大加快，這就為生成較多的活性氧創(chuàng)造了條件。Quinzii等研究表明，在原發(fā)性CoQ10缺乏造成呼吸鏈功能障礙中，ATP合酶受到抑制，ROS產(chǎn)生增加，引起脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化損傷。
2．2活性氧產(chǎn)生機(jī)制——電子漏與質(zhì)子漏
在線粒體呼吸過程中，電子傳遞中途“漏出”少量電子直接單價(jià)還原氧分子形成O2·-，即線粒體電子漏(electron leak)，研究表明，線粒體呼吸鏈電子漏是運(yùn)動(dòng)性內(nèi)源ROS產(chǎn)生的重要來源。在運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于機(jī)體代謝增加，耗氧量激增，進(jìn)入呼吸鏈的氧還原量增加，電子漏出呼吸鏈概率增加，引起O2·-生成速率增加。文獻(xiàn)研究表明，運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體O2·-生成顯著增高，脂質(zhì)過氧化顯著增加，說明電子傳遞過程中電子漏形成的O2·-是運(yùn)動(dòng)性內(nèi)源ROS的重要來源。若電子傳遞鏈過程中泵出的質(zhì)子通過其他途徑返回線粒體基質(zhì)，形成“質(zhì)子漏(protein leak)”，會(huì)破壞內(nèi)膜兩側(cè)的電化學(xué)梯度，使ATP生成受到抑制。目前，質(zhì)子漏現(xiàn)象發(fā)生的分子機(jī)制尚不清楚。劉樹森等提出線粒體態(tài)4呼吸中的電子漏產(chǎn)生的O2·-可能作為內(nèi)源性質(zhì)子載體，即“電子漏引起質(zhì)子漏學(xué)說”。時(shí)慶德等在運(yùn)動(dòng)性疲勞的線粒體膜分子機(jī)制的研究顯示，O2·-生成增加、態(tài)4呼吸速率明顯加快、磷氧比顯著下降，表明力竭性運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌線粒體電子漏導(dǎo)致線粒體質(zhì)子漏增多，是運(yùn)動(dòng)性疲勞狀態(tài)下線粒體氧化磷酸化偶聯(lián)程度下降的重要因素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持電子漏引起質(zhì)子漏假說。研究認(rèn)為，活性氧產(chǎn)生與質(zhì)子漏之間存在一個(gè)反饋回路。線粒體在電子傳遞過程中“漏出”的少量電子直接單價(jià)還原氧分子形成O2·-，誘導(dǎo)質(zhì)子漏，導(dǎo)致氧化磷酸化解偶聯(lián)，抑制ATP的生成。但此過程可使線粒體內(nèi)膜跨膜電位不再升高，而維持在適宜的水平，因此電子漏途徑產(chǎn)生的ROS也是保護(hù)細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制之一。
2．3活性氧產(chǎn)生的反饋調(diào)節(jié)——解偶聯(lián)蛋白
解偶聯(lián)蛋白(UCPs)是存在于線粒體內(nèi)膜上的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與線粒體能量代謝、活性氧生成及脂肪代謝有關(guān)。近年來研究表明，UCPs家族中UCP3主要分布在骨骼肌線粒體中，與運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，Zhou等研究發(fā)現(xiàn)，急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)30min即刻大鼠骨骼肌UCP3mRNA表達(dá)迅速增加，運(yùn)動(dòng)20min后達(dá)到安靜時(shí)的7倍，而UCP3蛋白在運(yùn)動(dòng)30min即刻也顯著升高。氧化磷酸化的“溫和解偶聯(lián)”(mild uncouplig)是調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生潛在機(jī)制，這種調(diào)節(jié)機(jī)制與解偶聯(lián)蛋白(UCPs)有關(guān)。Echtay等研究表明，在線粒體呼吸鏈ROS產(chǎn)生過量時(shí)，可激活線粒體內(nèi)膜上的UCPs，作為一個(gè)反饋的應(yīng)答并通過UCPs輕度的解偶聯(lián)作用降低ROS生成，保護(hù)線粒體不受氧化損傷。
近年來研究表明，UCPs可誘導(dǎo)線粒體內(nèi)膜質(zhì)子導(dǎo)性增強(qiáng)，研究認(rèn)為，由電子傳遞鏈產(chǎn)生的O2·-能夠激活UCPs的質(zhì)子導(dǎo)性，引起線粒體溫和解偶聯(lián)，ROS可能通過激活UCP3表達(dá)與質(zhì)子漏之間存在一個(gè)準(zhǔn)確的反饋調(diào)節(jié)回路。張勇等研究表明，在ROS遞增的同時(shí)，運(yùn)動(dòng)中UCP3mRNA和蛋白表達(dá)水平也呈相似趨勢，認(rèn)為UCP3表達(dá)增加可加大線粒體呼吸鏈質(zhì)子漏，促進(jìn)呼吸鏈電子傳遞，減少線粒體ROS生成及其可能引發(fā)的氧化損傷。張桂忠等認(rèn)為，隨著ROS大量生成，其可能通過“ROS-質(zhì)子漏”和“ROS-UCP3-質(zhì)子漏”2條途徑在運(yùn)動(dòng)中線粒體能量轉(zhuǎn)換的準(zhǔn)確調(diào)控中起“分子開關(guān)”作用，并作為始動(dòng)因素參與了呼吸鏈電子傳遞與能量轉(zhuǎn)換的能量分配的反饋調(diào)節(jié)，調(diào)控ATP生成。馬國棟等認(rèn)為，骨骼肌線粒體中UCP3水平的升高，可能增加線粒體內(nèi)膜質(zhì)子導(dǎo)性，降低線粒體內(nèi)膜電位，從而抑制線粒體ROS的過量生成。另有研究發(fā)現(xiàn)，UCP3基因敲除鼠，線粒體ROS生成增加，膜電位升高，表明UCP3蛋白能夠使膜電位保持在ROS大量產(chǎn)生的閾值之下，避免大量ROS的產(chǎn)生。體外研究表明，骨骼肌細(xì)胞中UCP3表達(dá)增加，同時(shí)脂肪酸氧化(fatty acid oxidalion，F(xiàn)AO)增加和ROS生成減少，提示UCP3與FAO和減少ROS生成有關(guān)。研究表明，ROS和脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)品可激活UCP3引起質(zhì)子漏，認(rèn)為是減少ROS生成的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)。Bevilacqua等對(duì)雄性FBNF1型鼠進(jìn)行長期能量限制(calorie restriction，CR)的研究表明，經(jīng)12個(gè)月和18個(gè)月后，線粒體中H2O2生成和氧化損傷降低，肌肉中UCP3含量增加；線粒體呼吸鏈質(zhì)子漏減少但無顯著性變化。線粒體ROS的生成可能通過激活UCPs表達(dá)引起質(zhì)子漏，進(jìn)而抑制ROS生成，但其調(diào)控機(jī)制尚需深入研究。
3小結(jié)
近年來，關(guān)于線粒體ROS的研究取得了較大進(jìn)展，尤其在ROS、電子漏與UCPs之間信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，為線粒體ROS領(lǐng)域的研究開闊了新的視野，推動(dòng)了運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激及機(jī)體抗氧化能力等方面的研究。在線粒體ROS產(chǎn)生及調(diào)節(jié)的分子機(jī)制和確切的生理學(xué)意義等方面仍需進(jìn)一步研究。