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作者：王琳琳凌文華
單位：王琳琳（中山醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)學(xué)營養(yǎng)系，廣東廣州510089）；
凌文華（中山醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)學(xué)營養(yǎng)系，廣東廣州510089）
疾病控制雜志2000年第1期第4卷講座與綜述
關(guān)鍵詞：mtDNA；氧化損傷；自由基；抗氧化作用；修復(fù)
【摘要】
線粒體中呼吸鏈產(chǎn)生的自由基是體內(nèi)自由基主要來源。在一定的生理(如年老)或/和病理條件下，自由基可以突破人體防御機(jī)制，損傷機(jī)體。由于線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)結(jié)構(gòu)功能特殊性，導(dǎo)致其成為自由基攻擊的主要且脆弱的靶目標(biāo)，從而引起線粒體功能障礙，結(jié)果造成細(xì)胞的衰老與死亡。在此將探討mtDNA氧化損傷的形成、防御及修復(fù)機(jī)制。
自由基可以廣泛攻擊體內(nèi)生物大分子，受損的蛋白質(zhì)、脂類可經(jīng)降解，再重新合成；但核酸分子損傷后一般不被降解而直接修復(fù)，未被修復(fù)的損傷DNA片段可積累下來，造成進(jìn)一步更大的損害。由于mtDNA缺乏組蛋白，與氧化磷酸化場所(線粒體內(nèi)膜)相距甚近，復(fù)制快速且無校讀功能(proofreading)以及缺乏有效的DNA修復(fù)機(jī)制，所以mtDNA較易受自由基攻擊，氧化損傷而引起突變，其突變率是核DNA的10倍。由于線粒體是機(jī)體的“動力工廠”，mtDNA損傷可導(dǎo)致線粒體功能缺陷，引起細(xì)胞能量不足而造成細(xì)胞的衰老與死亡。大量研究發(fā)現(xiàn)mtDNA氧化損傷與線粒體肌病、神經(jīng)變性疾病和衰老密切相關(guān)。本文就這一氧化損傷發(fā)生、發(fā)展及防御機(jī)制的研究情況綜述如下。
1 mtDNA的結(jié)構(gòu)功能特征
mtDNA呈閉環(huán)雙鏈狀，獨(dú)立存在于核外。每個細(xì)胞含數(shù)百個線粒體，每個線粒體含2～10個基因組DNA。人類mtDNA含16569 bp，其全部序列已被測定。它包含22個tRNA基因，2個rRNA基因，13個與線粒體氧化磷酸化有關(guān)的蛋白質(zhì)基因。
與核DNA相比，mtDNA在結(jié)構(gòu)和功能上有著自己獨(dú)特的特征：
①mtDNA是裸露的，缺乏組蛋白和DNA結(jié)合蛋白的保護(hù)；
②mtDNA與氧化磷酸化場所(線粒體內(nèi)膜)相距甚近，又直接暴露于氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的高反應(yīng)性氧中，因此易受自由基的攻擊；
③mtDNA復(fù)制快速且催化復(fù)制的DNA聚合酶γ不具有校讀功能，復(fù)制錯誤率高；
④mtDNA與核DNA相比缺乏有效的修復(fù)機(jī)制；
⑤每個細(xì)胞中含有數(shù)百個線粒體，每個線粒體含多個DNA分子，所以細(xì)胞中可同時存在正常mtDNA和突變mtDNA，即異質(zhì)性；
⑥mtDNA無內(nèi)含子，所以mtDNA的突變很容易影響到其基因組內(nèi)的一些重要功能區(qū)域；
⑦突變mtDNA是否在組織產(chǎn)生表型效應(yīng)，這要依突變mtDNA與正常mtDNA相對比例和該組織對線粒體產(chǎn)生的ATP依賴程度而定；
⑧線粒體是半自主性細(xì)胞器，mtDNA基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯受核DNA的制約；
⑨線粒體位于胞質(zhì)中，故mtDNA的遺傳方式是細(xì)胞質(zhì)遺傳(母系遺傳)，相應(yīng)地有些線粒體病亦為母系遺傳，如線粒體腦肌病、糖尿病等。因此，在研究mtDNA損傷過程中必須要考慮到這些特征。
2 mtDNA氧化損傷的形成
2.1自由基的產(chǎn)生與Fenton反應(yīng)
自由基主要來源于線粒體氧化磷酸化過程，它是指任何含有一個或多個不成對電子并能獨(dú)立存在的基因，如H·、、OH·、RO·、RO2·、NO·等。約1%～2%線粒體呼吸鏈消耗的氧被轉(zhuǎn)化為，CoQ與NADH脫氫酶是這一轉(zhuǎn)化過程發(fā)生的主要位點(diǎn)；來源于線粒體外膜的單胺氧化酶-A/B對生物胺的氧化可以產(chǎn)生H2O2，這比復(fù)合物Ⅱ介導(dǎo)的琥珀酸氧化生成H2O2量要高48倍。
Fenton反應(yīng)是針對于過渡性金屬而言，過渡性金屬除了一種基本狀態(tài)外，還可形成不止一種的氧化態(tài)，這樣就允許一個電子的氧化還原反應(yīng)。Fenton與后來的Haber和Weiss研究建立了Fenton反應(yīng)基本方程式：Fe2++H2O2→Fe3++HO·+HO-
細(xì)胞內(nèi)Fe較Cu、Co的相對優(yōu)勢以及其與螯合配體高親和力表明：Fe在體內(nèi)Fenton反應(yīng)中起重要作用。經(jīng)Fenton反應(yīng)生成的Fenton氧化劑是以·OH為典型代表，羥基化和奪取氫是其兩種常見的反應(yīng)形式。
金屬螯合劑由于占用了金屬螯合位點(diǎn)而可阻止Fenton反應(yīng)。在哺乳動物細(xì)胞中，去Fe制劑(desferal)和啡啉(o-phenanthroline金屬螯合劑)可防止H2O2引起的姐妹染色體交換、DNA單鏈斷裂及細(xì)胞損傷。
2.2 Fenton氧化劑導(dǎo)致mtDNA損傷機(jī)理
在H2O2依賴性的DNA損傷中，自由基攻擊對象及性質(zhì)取決于Fe附著于DNA的位點(diǎn)而非羥自由基。Fe介導(dǎo)的Fenton氧化劑按DNA損傷機(jī)制至少可分為兩種截然不同的類型，類型Ⅰ氧化劑對H2O2、乙醇中度敏感，并選擇性裂解DNA的堿基T；類型Ⅱ氧化劑對H2O2、乙醇高度敏感，并選擇性裂解DNA的堿基G。這些自由基迥然不同的損傷特征主要是由于介導(dǎo)產(chǎn)生它們的Fe所附著位置不同。
自由基攻擊堿基主要導(dǎo)致·OH加合于富含電子的DNA雙鏈，尤其在嘌呤N-7-C-8位點(diǎn)和嘧啶5、6-位點(diǎn)上，一般地，F(xiàn)enton氧化劑可攻擊DNA堿基，也可攻擊糖基。攻擊糖基時，先脫氧核糖鏈上一核糖被奪取氫，然后導(dǎo)致鏈斷裂，堿基逸失。自由基攻擊堿基部分并不能引起糖基改變或鏈斷裂，除非修飾的堿基改變了N-糖苷鍵以允許無堿基位點(diǎn)形成。在被修飾的堿基中，7、8-二氫-8-氧鳥嘌呤(NULL，8-dihydro-8-oxoguanine，8-oxo-Gua)和乙二醇胸腺嘧啶(thymine glycol，及其羥化物)受到廣泛的關(guān)注?？赡苡捎谕瑫r存在獨(dú)特切除酶的緣故，另外還可能由于8-oxo-Gua有高突變性和易于分離與定量。在mtDNA復(fù)制過程中8-氧脫氧鳥嘌呤核苷三磷酸(8-oxodeoxyguanosinetriphosphate，8-oxo-dGTP)有高突變率，與其在核中表現(xiàn)的一樣，應(yīng)與8-oxo-dGTP配對的A很容易被C置換，這種錯配mtDNA的穩(wěn)定存在為一些變性疾病奠定基因水平的基礎(chǔ)。
對于mtDNA而言，這些堿基、糖基的改變可導(dǎo)致點(diǎn)突變、缺失和插入突變，其中以片段缺失多見。至今已發(fā)現(xiàn)老年人不同組織的mtDNA缺失類型有十幾種，其中某些缺失只見于某類組織，而另一些缺失卻可能在不同組織或器官中出現(xiàn)，4977 bp缺失是這些缺失中尤其普遍和研究非常多的類型。對應(yīng)大鼠mtDNA的常缺失是4834 bp缺失。
2.3不依賴于Fenton反應(yīng)的自由基致mtDNA氧化損傷
氮氧自由基的產(chǎn)生不需Fenton反應(yīng)，與NO·快速反應(yīng)生成ONOO-，另外ONOO-也可能與H2O2形成1-O2，這種氮氧自由基可以使DNA脫氨基并誘導(dǎo)其突變，還可以增強(qiáng)線粒體氧化應(yīng)激，及細(xì)胞對過氧化物介導(dǎo)損傷的敏感性。存在著與Fenton反應(yīng)無關(guān)的毒作用，如巴豆毒醇誘導(dǎo)白血球產(chǎn)生，并同時引起DNA單鏈斷裂，這種損傷對H2O2水解酶不敏感，且被啡啉誘發(fā)而不是抑制。
單線態(tài)氧的產(chǎn)生同樣不通過Fenton/H-W。例如，Cl-與H2O2反應(yīng)生成OCl-，后者再與H2O2生成單線態(tài)氧，前一反應(yīng)在體外被氯過氧化酶催化，在含有豐富H2O2和氯過氧化酶的嗜中性細(xì)胞中可見單線態(tài)氧的產(chǎn)生。單線態(tài)氧容易氧化DNA的鳥嘌呤。上述這些自由基對mtDNA的氧化損傷機(jī)理需要進(jìn)一步研究。
2.4脂類過氧化導(dǎo)致mtDNA損傷機(jī)理
已有證據(jù)支持膜脂過氧化作用與自由基誘導(dǎo)的mtDNA損傷密切相關(guān)。Nakayama等在1984年發(fā)現(xiàn)α-生育酚可通過將氫給予脂質(zhì)自由基而抑制DNA自由基的形成。兩年后，他又發(fā)現(xiàn)α-生育酚可以阻止甲基亞麻酸過氧化氫(methyl linoleate hydroperoxide)誘導(dǎo)的DNA損傷。Andrew M.H.于1988年觀察到作為使脂自由基失活的抗氧化劑α-生育酚可同時阻止脂質(zhì)過氧化和DNA損傷；而作為自由基、H2O2、·OH清除劑的SOD、CAT和甘露醇卻無此保護(hù)作用；如果說是因為這些清除劑不能進(jìn)入線粒體發(fā)揮作用的話，那么對于另一具有高度膜通透性的自由基清除劑二甲基亞砜，仍不能發(fā)現(xiàn)其有阻止脂質(zhì)過氧化和DNA損傷作用。
盡管脂質(zhì)過氧化作用誘導(dǎo)mtDNA損傷的確切機(jī)制并未得以闡明，但可以推測脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的LO·、LOO·等自由基可以發(fā)揮OH相似DNA攻擊作用，進(jìn)一步研究仍需繼續(xù)。
2.5 Cu誘導(dǎo)的mtDNA損傷
由于Cu可在氧化態(tài)和還原態(tài)之間反復(fù)改變，所以它是一種強(qiáng)的致氧化劑(prooxidant)，可產(chǎn)生·OH等自由基，同時Cu能夠形成Cu-DNA復(fù)合物，在DNA附近生產(chǎn)的自由基很容易攻擊這個靶目標(biāo)，因此Cu能引起核DNA單、雙鏈斷裂，堿基交聯(lián)、氧化、置換等。可推測在Cu過載狀態(tài)下，線粒體內(nèi)選擇性積累的Cu會以易受氧化損傷的mtDNA為靶目標(biāo)。而分布于胞漿與溶酶體的Fe即便在過載狀態(tài)下，亦不會積聚到線粒體，故不能誘導(dǎo)上述作用。若Cu清除途徑發(fā)生障礙，如編碼Cu-轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶的核基因發(fā)生突變，就會產(chǎn)生Wilson's疾病，其特征性體征就是與mtDNA損傷有關(guān)的微血管脂肪變性。
3機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)
3.1抗氧化酶類
常見的抗氧化酶有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱苷肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)等。哺乳動物細(xì)胞在胞漿產(chǎn)生Cu、Zn-SOD，在線粒體內(nèi)產(chǎn)生Mn-SOD。SOD可將轉(zhuǎn)化為H2O2。當(dāng)Cu、Zn-SOD、CAT、GSH-PX活性隨年齡增大而降低時，Mn-SOD活性卻不斷增高直至60歲，而后才開始下降，而且Mn-SOD/CAT、Mn-SOD/GSH-PX活性比隨年齡增大而增加，這表明自由基清除酶在60歲以前可以有效清除自由基，但60歲后，自由基的產(chǎn)生與清除就會失衡，而產(chǎn)生氧化應(yīng)激，可見，自由基清除酶的功能下降與氧化應(yīng)激的不斷增強(qiáng)，對于人類衰老進(jìn)程中發(fā)生中的mtDNA氧化損傷起著重要的作用。
然而有研究發(fā)現(xiàn)在低濃度或高濃度SOD狀態(tài)下，脂質(zhì)過氧化均明顯，而在中度濃度SOD狀態(tài)下，脂質(zhì)過氧化降低到更小程度，這可能由于在脂質(zhì)鏈?zhǔn)窖趸^程中，可同時起啟動與終止的作用。所以固然SOD抗氧化作用良好，但體內(nèi)SOD濃度并非愈高愈好。
CAT與GSH-PX同時起著水解H2O2作用。在哺乳動物細(xì)胞中，CAT大多存在于過氧化物酶體中，且分泌較少，而GSP-PX則可廣泛存在于線粒體、胞漿、過氧化物酶體，且作用強(qiáng)于CAT，特異性低于CAT，故可降解有機(jī)過氧化物，氧化的谷胱甘肽可由NADPH依賴的GSH還原酶還原。
SOD、CAT、GSH-PX三者相對水平的高低對于它們抗氧化作用的有效發(fā)揮很重要。例如，增加的SOD消耗了，但增多了H2O2，過多的H2O2若不能被CAT、GSH-PX及時清除，就會有害于機(jī)體，然而過多的GSH-PX并不必要，它過分消耗了GSH和NADPH，盡管存在著足量的CAT。
白細(xì)胞內(nèi)還含有硫醇特異性抗氧化酶，在低濃度H2O2(～50μm)狀態(tài)下發(fā)揮硫醇依賴的過氧化物酶的作用：高濃度H2O2(～10 mm)時，這種酶可以阻止由于硫醇/金屬催化氧化造成的DNA損傷，然而這種保護(hù)作用在過氧化物酶體中并未發(fā)現(xiàn)。
對DNA而言，僅有效防御自由基的措施是非酶性的，組蛋白和緊密完整的染色體結(jié)構(gòu)可以有效地保護(hù)DNA，然而mtDNA卻缺乏組蛋白的保護(hù)及其它DNA結(jié)合蛋白，這是mtDNA對氧化損傷敏感性較核DNA高的重要原因之一。
3.2抗氧化劑
大量研究已證實(shí)，VitE、VitC在體內(nèi)具有強(qiáng)的抗氧化特性。近年研究也發(fā)現(xiàn)，VitE、VitC可以延緩mtDNA遭受與衰老相關(guān)的損傷。在研究AZT(一種治療AIDS的藥物)對骨骼肌mtDNA氧化損傷作用時發(fā)現(xiàn)，飲食中補(bǔ)允VitE、VitC的病人，服用AZT的副作用明顯減弱。β-胡蘿卜素也具有清除自由基的作用。氧自由基連鎖反應(yīng)過程及其與抗氧化系統(tǒng)的關(guān)系可概括如下，見圖1。
圖1氧自由基連鎖反應(yīng)過程及其與抗氧化系統(tǒng)的關(guān)系
4 mtDNA氧化損傷的修復(fù)
正常狀態(tài)下，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)完全可以抵御自由基的攻擊，一旦由于各種原因，抗氧化防御系統(tǒng)作用減弱或自由基產(chǎn)生過多而突破機(jī)體防御系統(tǒng)，那么mtDNA就會很容易發(fā)生損傷，這時，mtDNA的損傷修復(fù)系統(tǒng)就要啟動。以前多數(shù)研究者認(rèn)為，mtDNA缺乏有效的修復(fù)機(jī)制，然而近年來，不斷的研究發(fā)現(xiàn)線粒體還是具有一定的DNA氧化損傷修復(fù)能力的。
4.1堿基切除修復(fù)
堿基切除修復(fù)被證實(shí)是通過一種DNA糖基酶，這種酶可以識別損傷的堿基，裂解其糖苷鍵。在細(xì)菌與哺乳動物細(xì)胞中有三種蛋白質(zhì)參與G損傷修復(fù)：8-oxo-GuaDNA糖基酶/AP水解酶(Fpg Pro.或MutM)；A DNA糖基酶(MutY)，這種酶可以識別并切除與8-oxo-Gua錯配的堿基A；8-oxo-dGTP酶(MutT)，此酶可以水解8-oxo-dGTP，生成8-oxo-dGMP。這樣，損傷的G就不會再插入新合成的DNA中。目前，F(xiàn)pg Pro.與MutT類似物已經(jīng)從線粒體中分離出來，線粒體中是否存在MutY類似物仍需進(jìn)一步探討。
對于單線態(tài)氧誘導(dǎo)的DNA堿基損傷，在線粒體中也存在著快速而有效的修復(fù)，另外線粒體內(nèi)還存在AP內(nèi)切酶、尿嘧啶DNA糖基酶等。
4.2核苷切除修復(fù)
這一過程需要多種酶復(fù)合體同時參與，導(dǎo)致一段寡核苷酸鏈的切除。這一復(fù)雜的修復(fù)過程目前還未在線粒體中發(fā)現(xiàn)。已證實(shí)對于UV誘導(dǎo)的二聚體，線粒體缺乏修復(fù)能力。然而線粒體卻可以修復(fù)4-硝基喹啉(4-Nitroquinoline)誘導(dǎo)的DNA損傷，而在核內(nèi)4-硝基喹啉(4-Nitroquinoline)的損傷是通過核苷切除修復(fù)途徑修復(fù)的，是否有核苷切除修復(fù)蛋白質(zhì)與線粒體修復(fù)過程還未知。
4.3重組修復(fù)
田鼠的mtDNA可以通過重組修復(fù)去除Cisplatin(含重金屬化合物)引起的鏈內(nèi)交聯(lián)；Thyagrajan B等在體外用人體線粒體蛋白質(zhì)抽提物可以在質(zhì)粒間建立重組，此實(shí)驗有力地支持了這一假設(shè)：哺乳動物線粒體可以利用同質(zhì)性堿基重組修復(fù)損傷的DNA。
綜上述所，mtDNA擁有一定的自我修復(fù)能力，然而大量研究顯示mtDNA遭受比核DNA高數(shù)十倍的突變率，是否線粒體中氧化應(yīng)激水平太高了，以致于即便具有效的修復(fù)系統(tǒng)，也不能維持一種低損傷水平?或者根本上，mtDNA的氧化損傷并不高于核DNA，而以前報告的8-oxo-dG水平偏高，可能由于分離過程中人工氧化所致?
5結(jié)束語
mtDNA的氧化損傷可導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能障礙，從而引起細(xì)胞能量代謝削弱，造成細(xì)胞壞死和凋亡，對能量需求較高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)及肌肉組織會因此受到累及，而出現(xiàn)功能障礙甚至疾病。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)越來越多的疾病與mtDNA損傷突變有關(guān)，如Kearns-Sayre綜合征、Leber's遺傳性神經(jīng)病、Parkinson's病、慢性遺傳性舞蹈病等。mtDNA損傷與衰老關(guān)系也已成為目前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。所以，闡明mtDNA氧化損傷的機(jī)制在理論上和臨床實(shí)踐上都具有重要意義。
然而在這一領(lǐng)域內(nèi)還需要進(jìn)一步開展大量的研究工作，mtDNA氧化在整個細(xì)胞氧化應(yīng)激中重要性，mtDNA損傷突變與線粒體功能缺陷、細(xì)胞凋亡關(guān)系如何，mtDNA損傷突變與衰老孰因孰果等等問題都有待于解決。
【作者簡介】
王琳琳(1976-)，女，安徽泗縣人，在讀碩士研究生
凌文華(1956-)，男，安徽巢湖人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，院長，主要研究方向：營養(yǎng)與疾病，1989～1997年在芬蘭、加拿大、美國留學(xué)與工作。