《遼寧體育科技》2013年第6期
劉建軍孫岳
遼寧省體育科學研究所遼寧沈陽110179
收稿日期：2013-07-03；修回日期：2013-12-06
作者簡介：劉建軍(1983-)，男，助理研究員，碩士，研究方向：運動人體科學。
摘要：
目的：
采用大鼠下坡跑運動損傷模型，研究離心力竭運動后不同時刻大鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化，探討離心力竭運動所致骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷機制，為科學運動訓練及運動恢復提供實驗和理論依據(jù)。
方法：
雄性SD大鼠60只隨機分為6組（每組10只）：安靜對照組、運動后即刻組、12h組、24h組、48h組和72h組，以速度16m/min，坡度-16°進行跑臺運動，運動100min，休息5min，再運動100min，在不同時刻觀察大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化。
結(jié)果：
運動后即刻肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性與對照組相比顯著下降（P＜0.01），隨后開始恢復，運動后24h接近對照組水平（P＞0.05），運動后48h已完全恢復到對照組水平。
結(jié)論：
離心力竭運動后即刻大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性顯著下降，隨后逐漸恢復，運動后24h明顯恢復，至48h已完全恢復，肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化可以間接評定運動后骨骼肌的損傷。
肌漿網(wǎng)的蛋白質(zhì)中70％～90％為Ca2+-ATPase，即鈣泵蛋白。運動過程中，肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活力的降低將直接影響肌漿網(wǎng)Ca2+調(diào)節(jié)能力。Ca2+轉(zhuǎn)運功能的變化不僅會直接影響肌肉收縮功能，而且會造成細胞漿中游離Ca2+濃度增加，后者可以通過激活蛋白水解酶和磷脂酶等造成肌纖維蛋白的降解，從而引起肌肉超微結(jié)構(gòu)的異常和收縮機能的下降，影響骨骼肌運動能力。有研究認為Ca2+在運動性肌肉微損傷中起著重要的作用，可能是其產(chǎn)生的一個中樞機制。本實驗采用一次性力竭離心運動模型，通過研究一次性力竭運動對大鼠損傷特別嚴重的前肢肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化進一步探討離心運動后骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷的內(nèi)在機制，為制定科學合理的運動訓練方案，防治運動訓練損傷提供理論和實驗依據(jù)。
1實驗對象與方法
1．1實驗對象
成年雄性SD大鼠60只，體重(298．13±12．68)g。自然光照，室溫(22±3)℃、濕度(55±5)％，分籠飼養(yǎng)，自由飲食。所有動物在實驗前均未進行過跑臺運動。
1．2實驗方法
1．2．1實驗動物分組
篩選具有正常跑臺下坡跑能力的大鼠，根據(jù)體重隨機分為6組：安靜對照組(Con)、運動后即刻組(E0)、12h組(E12)、24h組(E24)、48h組(E48)和72h組(E72)，每組10只大鼠。
1．2．2力竭模型
實驗前3天，所有大鼠進行5min～10min跑臺運動，以熟悉跑臺，速度為(5～10)m/min，坡度為0°。實驗時，所有運動組大鼠均在小動物電動跑臺上進行持續(xù)性下坡跑運動，速度為16m/min，坡度為-16°，運動100min后，休息5min，然后再運動100min，總運動時間為200min。根據(jù)Bedford對大鼠不同運動方式與至大攝氧量消耗關系的研究，確定此運動強度相當于至大攝氧量的70％～75％。運動中使用聲、光刺激或毛刷刺激大鼠尾部，驅(qū)使其運動。運動結(jié)束后，將動物放回籠中，同樣條件飼養(yǎng)，直到處死。
1．2．3測試樣本的采集
取材時間分別在運動后即刻、12h、24h、48h、72h。大鼠在處死前，先稱取體重，通過腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉，麻醉劑量為(0．25～0．5)g/kg體重。隨后迅速取大鼠右側(cè)前肢肱三頭肌組織，放入冷生理鹽水中洗去浮血，剔除脂肪及結(jié)締組織，用濾紙吸干后，迅速放入液氮冷凍，然后再放入-80℃低溫冰箱儲存，留做肌漿網(wǎng)的制備。肌漿網(wǎng)的制備參照Carl方法進行。
1．2．4肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性的測定
采用南京建成生物工程研究所提供的超微量ATP酶試劑盒，測試儀器為6010紫外可見分光光度計，具體測試方法見試劑盒說明書。
1．2．5實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
使用SPSS13．0分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，所有實驗數(shù)據(jù)均以x±SD表示，各組間運用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行比較，以P<0．05為具有顯著性差異，以P<0．01為具有非常顯著性差異。
2結(jié)果
2．1力竭運動前后大鼠一般情況的對比觀察
安靜對照組大鼠表現(xiàn)為神態(tài)安靜，眼睛有神，活潑好動，對實驗者捕捉的逃避反應比較敏感。運動組大鼠起初在跑臺上進行下坡跑運動時，都在跑道前邊跑，步態(tài)正常，跑速比較均勻；隨著運動時間的增加，跑步姿勢發(fā)生了變化，四肢表現(xiàn)為無力，腹部與跑道面接觸，有的甚至出現(xiàn)臥位跑，并且逐漸向跑道后移動，跑速不均勻；運動到近200min時，大鼠反應更加遲鈍，腹部皮毛濕潤，四肢足部腫脹，所有大鼠都在跑道后部跑動，跑速明顯不均勻，不能跟隨跑道皮帶的速度。運動結(jié)束后，大鼠表現(xiàn)為神態(tài)倦怠，眼睛暗淡無光，伏地喘息，反應遲鈍，幾乎沒有逃避反應，根據(jù)大鼠力竭的標準，可以判斷大鼠已經(jīng)力竭。
2．2運動后不同時刻大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化
由表1和圖1可見，安靜時大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性為(9．46±1．42)U/mgprot，力竭運動后即刻肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性明顯降低，為(5．41±1．46)U/mgprot，較運動前下降了42．81％(P<0．01)；運動后12h肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性為(7．61±1．38)U/mgprot，較運動前下降了19．56％(P<0．05)，比運動后即刻升高了40．67％(P<0．01)；運動后24h肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性為(8．51±1．16)U/mgprot，較運動前下降了10．04％(P>0．05)，比運動后即刻升高了57．30％(P<0．01)，與安靜組相比沒有顯著性差異；運動后48h與運動后72h肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性分別為(9．06±1．55)U/mgprot和(9．34±1．411)U/mgprot，與安靜對照組相比無顯著性差異，提示已恢復到正常值。
3分析與討論
3．1大鼠運動性骨骼肌微損傷模型的建立
在動物模擬性實驗研究中，建立或復制動物模型是研究的重要環(huán)節(jié)，模型的適用性、可靠性和可行性直接關系到實驗結(jié)果的科學性。
肌肉進行高強度、大負荷的運動容易引起骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，關于一次性離心力竭運動后不同時刻大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化研究較少。運動導致的骨骼肌微損傷不僅與運動強度和時間有關，而且與運動中骨骼肌的收縮方式有著密切的聯(lián)系。Armstrong RB等用大鼠模型研究了相同強度的離心收縮(下坡跑)和向心收縮(上坡跑)對骨骼肌損傷的不同效應，通過組織學觀察以及有關的生物化學和組織化學指標證實離心收縮相對向心收縮運動導致骨骼肌的損傷更大。Newham等用肌肉活檢技術(shù)研究了上(向心收縮)、下(離心收縮)臺階運動后人體股四頭肌超微結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明，離心收縮運動導致的人體骨骼肌損傷程度明顯比向心收縮運動后的嚴重。McHugh MP等研究發(fā)現(xiàn)，離心收縮過程中產(chǎn)生單位力矩的EM(表面肌電圖)信號低于向心收縮。同時，Rall JA發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生相同力量的離心收縮所消耗的能量較相應的向心收縮少。表明離心收縮時只有一小部分運動單位被選擇性地募集參與收縮過程，因此離心收縮時較大的力量就由較少的運動單位來承擔，從而導致每根肌纖維相對向心收縮承受更大的張力。因此，目前多數(shù)研究者認為，離心收縮中骨骼肌纖維承受較大的張力可能會導致肌纖維和支持它們的結(jié)締組織的機械損傷。
大鼠在下坡跑運動中，肌肉抵抗體質(zhì)量形成的運動負荷進行離心收縮做功。大鼠主要的工作肌肉是前肢肌肉，而對其后肢，由于體質(zhì)量的分布原因，作用效果相對較小。因此本實驗選取了大鼠前肢的肱三頭肌作為主要研究的肌肉。
3．2離心力竭運動對大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的影響
肌漿網(wǎng)是骨骼肌細胞內(nèi)一種重要的鈣貯存器，在哺乳動物骨骼肌的Ca2+調(diào)節(jié)中起主要的作用。有研究表明，Ca2+濃度升高的90％是由肌漿網(wǎng)釋放的，而舒張期胞漿內(nèi)Ca2+濃度降低的70％～75％也是由肌漿網(wǎng)攝取并貯存在肌漿網(wǎng)內(nèi)的。肌漿網(wǎng)通過Ca2+的攝取和釋放參與細胞漿中Ca2+濃度的調(diào)節(jié)，在興奮-收縮偶聯(lián)中起關鍵作用。盡管骨骼肌損傷是多種機制共同作用的結(jié)果，但是肌漿網(wǎng)對Ca2+攝取功能的改變是其一個重要的原因，并且在骨骼肌疲勞及損傷的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的生理功能。
在肌肉重復性收縮過程中，由于某些因素使肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性降低，肌漿網(wǎng)鈣代謝功能異常，影響肌漿網(wǎng)鈣泵系統(tǒng)將胞漿中游離的多余Ca2+攝入肌漿網(wǎng)中，使運輸回肌漿網(wǎng)的Ca2+量減少、速度減慢，并造成細胞漿中游離Ca2+濃度增加，使肌動蛋白和肌球蛋白形成的橫橋分離速度減慢，肌肉無法維持反復性的收縮，結(jié)果因為Ca2+濃度的干擾延長了肌肉放松的時間，導致骨骼肌肌纖維的損傷。Byld以馬為實驗對象，研究高強度力竭運動對肌漿網(wǎng)功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運動后即刻臀肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性有所下降。田野讓大鼠在零坡度，以18m/min的速度在跑臺上持續(xù)跑100min力竭，運動后即刻發(fā)現(xiàn)大鼠股四頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性有明顯變化，較運動前下降了18．74％。李潔讓大鼠以同樣的方式運動，發(fā)現(xiàn)腓腸肌和比目魚肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性都比對照組有顯著性下降。王翔等讓大鼠在坡度為零的跑臺上運動至力竭，發(fā)現(xiàn)大鼠紅肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性顯著地降低(P<0．05)，白肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性非常顯著地降低(P<0．01)。Yasuda等觀察了大鼠在中等強度和高強度兩種運動負荷情況下比目魚肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase的變化，結(jié)果顯示兩種負荷運動后即刻肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase的活性均顯著性下降。
在本研究中，運動后即刻大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性比安靜時下降了42．81％(P<0．01)，提示長時間耐力運動后肌漿網(wǎng)功能有所下降，Ca2+調(diào)節(jié)能力減弱，與許多研究結(jié)果相同。運動后12h大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性比安靜時下降了19．56％(P<0．05)，比運動后即刻升高了40．67％(P<0．01)，說明肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性開始恢復，運動后24h肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶活性較運動前下降了10．04％(P>0．05)，比運動后即刻升高了57．30％(P<0．01)，與安靜組相比沒有顯著性差異，肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性接近安靜組水平；運動后48h與72h肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性與安靜組相比沒有顯著性差異，已完全恢復到正常值。
肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的下降必然會影響肌漿網(wǎng)對Ca2+的攝取。李潔的研究結(jié)果顯示，運動后腓腸肌肌漿網(wǎng)的Ca2+轉(zhuǎn)運速率下降了47．94％。魏源等讓大鼠在跑臺上零坡度運動至力竭，運動后肌漿網(wǎng)Ca2+攝取率較運動前下降了17．72％(P<0．01)。James A讓受試者在功率自行車上以75％至大攝氧量持續(xù)運動直到疲勞，發(fā)現(xiàn)運動后肌漿網(wǎng)Ca2+攝取率下降了25％。J．D．Schemer等讓大鼠進行跑臺運動，研究結(jié)果顯示運動后大鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+攝取率比安靜組有明顯的降低。
從以上研究結(jié)果可以看出，在長時間力竭性運動后即刻肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性顯著下降，Ca2+轉(zhuǎn)運機能發(fā)生了變化，使胞漿內(nèi)Ca2+濃度增高，造成骨骼肌收縮機能下降，引起肌肉疲勞甚至損傷。因此，肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化可以間接評定運動后骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的損傷。
4結(jié)論
本實驗采用的離心力竭跑臺實驗，使大鼠產(chǎn)生力竭。運動后即刻大鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性顯著下降，隨后逐漸恢復，24h后明顯恢復，至48h已完全恢復。提示肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶活性的變化可以作為評定運動后骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷的一個指標。