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《中華實(shí)驗(yàn)外科雜志》2005年01期
【作者單位】：福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科
摘要：
目的：
探討白細(xì)胞介素-1(IL-1)介導(dǎo)大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制。
方法：
24只健康雄性SD鼠，隨機(jī)分為：
假手術(shù)組：僅行頸外靜脈插管術(shù)；
損傷組：缺血4 h，再灌注4h；
干預(yù)組：缺血4 h，再灌注即刻經(jīng)靜脈導(dǎo)管給與白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra).采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測定骨骼肌和肺組織白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)mRNA表達(dá)；
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)測定血漿IL-1β水平；
比色法檢測血漿乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)和組織過氧化物酶(MPO)含量及電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)的改變。
結(jié)果：
應(yīng)用IL-1ra后，IL-1βmRNA水平明顯降低(骨骼?。?.73±0.35較1.20±0.42，P＜0.01；肺：1.15±0.23較1.70±0.30，P＜0.01)；
血漿IL-1β水平顯著下降(P＜0.01)；
CK(76.77±18.28較127.07±28.34，P＜0.01)、LDH(16 540.85±1 020.63較23 370.61±2 160.54，P＜0.01)、MDA(7.22±1.65較9.73±1.91，P＜0.01)和MPO(骨骼肌：2.24±0.38較4.43±0.65，P＜0.01；肺：1.13±0.16較2.71±0.32，P＜0.01)含量均明顯降低，骨骼肌和肺組織超微結(jié)構(gòu)損傷減輕。
結(jié)論：
骨骼肌缺血-再灌注激發(fā)IL-1的生成，在介導(dǎo)骨骼肌和肺的損傷中起著重要作用。
骨骼肌缺血再灌注損傷(SMIRI)常見于溶栓、Fogarty導(dǎo)管取栓、斷肢再植、四肢大血管損傷等疾病恢復(fù)血流后。它的發(fā)生與過度炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。IL-1作為一種重要的促炎細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起重要的作用。我們以大鼠后肢缺血再灌注為模型，旨在觀察IL-1在SMIRI中的作用。
材料與方法
1．動物模型及分組清潔級健康雄性SD大鼠24只(福建醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重250～300g，隨機(jī)分為3組，每組8只。參照Crinnion等法建立模型。實(shí)驗(yàn)分組：
(1)A組為假手術(shù)組，頸外靜脈插管，左后肢無張力環(huán)繞止血帶。
(2)B組為損傷組，缺血4h，再灌注4h，松開止血帶時經(jīng)靜脈導(dǎo)管注入0．5ml生理鹽水。
(3)C組為干預(yù)組，缺血4h，再灌注4h，松開止血帶時經(jīng)靜脈導(dǎo)管注入IL-1ra(2mg/kg)。
2．主要試劑：
IL-1ra(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)，IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒(深圳晶美公司)，TrizolRNA抽提試劑盒(Gibcol BRL公司)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(Takara公司)，丙二醛、肌酸激酶、乳酸脫氫酶、過氧化物酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。PCR引物由上海博亞公司合成，大鼠IL-1β基因上游引物：5’-GCAGGCTTCGAGATGAACAAC-3’，下游引物：5’-GCCGTCTTTCATCACACAGGA-3’，擴(kuò)增片段約208bp。大鼠GAPDH內(nèi)參引物序列：上游引物：5’-CTAAGTGTAGCCCAGGATGC-3’，下游引物：5’-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3’，擴(kuò)增片段約508bp。
3．骨骼肌和肺組織總RNA提取及IL-1βmRNA基因表達(dá)：
再灌注4h后取大鼠左后肢骨骼肌(腓腸肌)及肺組織50～100mg分別加入1ml Trizol用玻璃勻漿器充分勻漿，提取總RNA。骨骼肌擴(kuò)增條件為：94℃變性30s，50℃30s，72℃30s，共30循環(huán)，72℃延伸7min。肺組織擴(kuò)增條件為：94℃變性30s，53℃30s，72℃30s，共30循環(huán)，72℃延伸7min。經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳后用GeL-Proanalyzer凝膠成像儀分析處理。
4．血漿IL-113含量檢測：
再灌注0、60、120、240min經(jīng)頸靜脈采血按ELISA方法檢測。
5．MDA、CK、LDH、MPO測定：
再灌注4h經(jīng)頸動脈取血并取骨骼肌及肺組織按常規(guī)用比色法檢測。
6．電鏡檢查：
骨骼肌取材后依次經(jīng)3％戊二醛-1．5多聚甲醛混合液固定，1％鋨酸固定，乙醇丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鈣雙重染色后，用HU-12A型電鏡觀察并攝像。
7．統(tǒng)計(jì)方法：
數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用Levene法行方差齊性檢驗(yàn)。方差齊，用單因素方差分析，組間及組內(nèi)用LSD檢驗(yàn)：方差不齊，用Games-Howell法進(jìn)行分析。
結(jié)果
1．骨骼肌和肺IL-1β基因表達(dá)的變化：
損傷組IL-1β的表達(dá)明顯增高(P<0．01)，干預(yù)組表達(dá)降低(P<0．01，表1)。
2．血漿IL-1β的變化：
骨胳肌再灌注后血漿IL-1β水平60min后明顯升高，120min達(dá)到高峰，干預(yù)組IL-1β明顯降低(圖1)。
3．血漿及組織生化指標(biāo)測定結(jié)果：
損傷組再灌注4h血漿中MDA、CK、LDH與骨骼肌、肺組織中MPO含量均增高，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。應(yīng)用IL-1ra可使這些指標(biāo)顯著降低(P<0．01，表2，3)。
4．電鏡觀察結(jié)果：
缺血-再灌注后4h，電鏡下可見骨骼肌肌絲、肌節(jié)排列紊亂，肌原纖維間隙增寬，線粒體腫脹變性，肌絲灶性溶解。肺泡腔內(nèi)見紅細(xì)胞、脫落上皮細(xì)胞或細(xì)胞碎片，局部基膜裸露。肺泡間隔內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張淤血。應(yīng)用IL-1ra后，上述病理變化明顯減輕。
討論
IL-1β是一種強(qiáng)烈的促炎細(xì)胞因子，除調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能外，還作用于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)和炎癥損傷中起著重要作用。以往研究證實(shí)IL-1β在缺血再灌注組織中表達(dá)升高，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示了相似的結(jié)果。過去研究還發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注可致肺組織IL-1βmRNA表達(dá)增加，本實(shí)驗(yàn)也證明了這一結(jié)果。由此表明再灌注激發(fā)的炎癥反應(yīng)或炎癥損傷可誘使組織自身合成IL-1β，通過自分泌或旁分泌的形式，使組織損傷加重，提示內(nèi)源性細(xì)胞因子IL-1β作為致病遞質(zhì)參與了再灌注后組織損害的發(fā)生發(fā)展。Ascer等觀察表明，骨骼肌缺血再灌注血漿中IL-1β含量顯著升高，與本實(shí)驗(yàn)損傷組血漿IL-1β含量升高相似，表明IL-1β是缺血再灌注激發(fā)的一種早期應(yīng)激因子，該因子的含量在一定程度反映了炎癥反應(yīng)或炎癥損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-1ra能顯著降低損傷組血漿中IL-1β含量及幅度，抑制IL-1β在骨骼肌和肺組織中的表達(dá)?？梢?，骨骼肌缺血再灌注早期應(yīng)用IL-1ra治療有助減輕IL-1β的過量表達(dá)，產(chǎn)生及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而可抑制SMIRI的發(fā)生、發(fā)展。
本研究結(jié)果顯示，損傷組血漿MDA和組織MPO顯著增加。MDA含量可反映脂質(zhì)過氧化程度并間接反映自由基的多少。MPO是中性粒細(xì)胞標(biāo)志酶，通過測定MPO能反應(yīng)中性粒細(xì)胞的浸潤程度。同時，血漿中骨骼肌細(xì)胞胞漿酶LDH、CK升高，組織超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯病理損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用IL-1ra能減輕脂質(zhì)過氧化程度及中性粒細(xì)胞的聚集；降低血漿中LDH、CK的含量并減輕組織損傷，證實(shí)IL-1β在SMIRI的發(fā)病過程中起關(guān)鍵性作用，IL-1ra對SMIRI具有保護(hù)作用。