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趙菁 白躍宏
《中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)》2009年第7期
上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院康復(fù)科上海市200233
趙菁，女，1982年生，山東省東平縣人，漢族，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院在讀碩士，主要從事下腰痛的臨床康復(fù)研究。
通訊作者：白躍宏，博士，主任醫(yī)師，上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院康復(fù)科，上海市200233
摘要：
背景：
端粒的長(zhǎng)度與細(xì)胞老化、永生化、癌變有密切的關(guān)系。
目的：
探討端粒長(zhǎng)度變化在腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征中的意義。
設(shè)計(jì)、時(shí)間及地點(diǎn)：
對(duì)比觀察，實(shí)驗(yàn)于2007-07／2008-02在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)基因組學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室完成。
對(duì)象：
25份豎脊肌組織標(biāo)本取自2007-05／09，年齡29～49歲，平均（34．7±12．6）歲，其中10份為正常人標(biāo)本，15份為腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者標(biāo)本，根據(jù)年齡正常標(biāo)本分為30～37歲和38～45歲2個(gè)對(duì)照組；非正常標(biāo)本分為29～34歲、35～43歲和44～49歲組，每組5例。
方法：
取各組標(biāo)本提取DNA，采用SouthenBloWing雜交技術(shù)，測(cè)量各組標(biāo)本豎脊肌組織骨骼肌細(xì)胞端粒長(zhǎng)度。
主要觀察指標(biāo)：
患者豎脊肌組織與正常組織端粒酶長(zhǎng)度。
結(jié)果：
腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者豎脊肌細(xì)胞平均端粒長(zhǎng)度明顯比正常人豎脊肌細(xì)胞平均端粒長(zhǎng)度短。且有顯著性差異（P＜0．05），44～49歲組較短，29～34歲組其次。
結(jié)論：
端粒的異常狀態(tài)參與腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征的發(fā)生。在腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征病變的過(guò)程中，端粒長(zhǎng)度明顯變短，與年齡有關(guān)。
0引言
端粒是真核細(xì)胞染色體末端的一種富含鳥(niǎo)嘌呤的DNA-蛋白復(fù)合體，是維持染色體結(jié)構(gòu)完整所需的。端粒的DNA由多種蛋白質(zhì)成分組成。人體端粒DNA由6個(gè)核苷酸重復(fù)序列TTAGGG組成。端?？杀Ｗo(hù)染色體末端不被降解，防止染色體相互融合、重組，減數(shù)分裂時(shí)維持染色體正確的配對(duì)移動(dòng)，并能防止DNA復(fù)制時(shí)末端序列的丟失，提高一些物種有絲分裂是染色體分離的準(zhǔn)確性。端粒在不同物種細(xì)胞中對(duì)于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用。目前，檢測(cè)端粒長(zhǎng)度（mean length of telomere restriction fragment，TRF)的變化及端粒酶的活性己成為人們研究細(xì)胞癌變、衰老和死亡的重要指標(biāo)之一。
作者采用Southen Blotting雜交技術(shù)對(duì)10例正常豎脊肌組織，15例腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者豎脊肌細(xì)胞端粒長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量。以探討其在腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者病變過(guò)程中骨骼肌細(xì)胞的變化，為臨床研究該疾病的病理轉(zhuǎn)歸提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
1對(duì)象和方法
設(shè)計(jì)：對(duì)比觀察。
時(shí)間及地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)于2007-07/2008-02在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)基因組學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）完成。
對(duì)象：25份豎脊肌組織標(biāo)本均取自2007-05/09，年齡29～49歲，平均(34．7±12．6)歲，其中正常人標(biāo)本10份，15份為腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者標(biāo)本，按年齡將正常標(biāo)本分為30～37歲和38～45歲2個(gè)對(duì)照組；非正常標(biāo)本分為29～34歲、35～43歲和44～49歲組，每組5例。根據(jù)國(guó)務(wù)院《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》規(guī)定，受試者均知情同意。
實(shí)驗(yàn)方法：
端粒長(zhǎng)度檢測(cè)方法：人的端粒重復(fù)序列是TTAGGG以CCCTAA或TTAGGG為探針，通過(guò)Southern雜交就可以測(cè)出端粒長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)采用TTAGGG為探針。
DNA抽提：將樣本剪成小塊，加入液氮中研磨成粉狀，酚原仿法常規(guī)抽提基因組DNA。經(jīng)AmershamGene Quant Pro核算蛋白定量?jī)x測(cè)定，所選樣品純度介于1．7～1．8，濃度＞0．5 g/L。
Southern blotting：按Telo TAGGG Telomere Lenth Assaykit所提供實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行。
①在各組樣本DNA中加入等量HinfⅠ和RsaⅠ進(jìn)行酶切。
②樣品酶切后，8 g/L瓊脂糖凝膠（含0．5 g/L EB)5 V/cm電泳樣品DNA20 u和120μL Marke混合物Ⅰ0．5h。
③凝膠置于0．25mol/L HCl中脫嘌呤5～10min，變性液（0．5 mol/L NaOH，1．5 mol/L NaCl）變性30min；中和液（0．5mol/L Tris，3mol/L NaCl pH 7．5)中和20min。
④正電荷尼龍膜（0．45μm)，毛細(xì)管虹吸法轉(zhuǎn)膜。20×SSC中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。時(shí)間6h，結(jié)束后，將膜在120℃下烘烤20min。
⑤DIG Easy Hyb液預(yù)雜交液42℃孵育1h，帶有地高辛標(biāo)記探針的DIG Easy Hyb雜交液42℃水浴振蕩過(guò)夜。Anti-DIG-AP工作液的準(zhǔn)備：為避免聚集的抗體導(dǎo)致背景升高，在配置前，先將抗體溶液在13000r/min下離心5 min。將Anti-DIG-AP用blocking solution，1x（Solution 11)稀釋至終濃度75 U/L（1：10．000)。
⑥Anti-DIG-AP工作液洗膜。
⑦室溫下碘化丙錠化學(xué)發(fā)光，X-ray曝光5～20min。
圖像獲?。河脪呙鑳x將尼龍膜上的圖像掃入磁盤(pán)，用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，圖像的吸光度值減去背景的吸光度值，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)Marker相對(duì)分子質(zhì)量，然后用軟件計(jì)算出圖像的端粒DNA片斷長(zhǎng)度。
主要觀察指標(biāo)：患者豎脊肌組織與正常組織端粒酶長(zhǎng)度測(cè)定結(jié)果。
設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者：第一作者設(shè)計(jì)試驗(yàn)并實(shí)施，通訊作者評(píng)估，經(jīng)過(guò)培訓(xùn)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：由第一作者利用SPSS13．0軟件微機(jī)處理分析數(shù)據(jù)。對(duì)正常組織和慢性骨筋膜間隔綜合征組織數(shù)據(jù)作χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)分析。
計(jì)算端粒平均長(zhǎng)度：按下列公式計(jì)算，L=∑（Ai×Li）/∑（Ai），雜交帶i處吸光度(Ai)、雜交帶i處吸光度（Ai）/i處DNA分子大?。↙i）（∑Ai/Li），Ai是所測(cè)條帶中對(duì)應(yīng)于每一個(gè)Marker位置上的吸光度值，Li為對(duì)應(yīng)的每一個(gè)Marker分子長(zhǎng)度。
2結(jié)果
腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者豎脊肌組織與正常組織端粒酶長(zhǎng)度見(jiàn)圖1和表1。
從表1中數(shù)據(jù)看出，正常組平均端粒長(zhǎng)度值8.29809～8.388441kb。腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征患者組平均端粒長(zhǎng)度值7.099784～7.423502kb，顯著縮短（P＜0.05），患者44～49歲組較短，29～34歲組其次。
其中以Li為11.28時(shí)，正常人和患者端粒DNA長(zhǎng)度見(jiàn)圖2；計(jì)算平均端粒長(zhǎng)度見(jiàn)圖3。
從圖2和圖3中可看到腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征組端粒長(zhǎng)度明顯縮短。
3討論
在實(shí)驗(yàn)中，15例非正常豎脊肌組織肌細(xì)胞端粒長(zhǎng)度均明顯縮短。在非正常組中，以5組縮短比較明顯，可能與病變程度和年齡有關(guān)。Melk等研究發(fā)現(xiàn)，端粒長(zhǎng)度隨年齡增加而變短。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Epithalon多肽具有提粒酶活性，延緩端粒變短作用。可見(jiàn)端粒的變短與端粒酶活性有密切關(guān)系。
單細(xì)胞真核生物中的端粒需要維持一定長(zhǎng)度，而人類細(xì)胞在正常情況下是非永生的，其端粒與其他真核生物的特點(diǎn)也相同。端粒的長(zhǎng)度與細(xì)胞老化、永生化、癌變有密切的關(guān)系，端粒酶的激活是端粒延長(zhǎng)的重要原因。然而，通過(guò)反饋調(diào)節(jié)作用；將端粒維持在一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)，如果這種監(jiān)控減弱或消失，細(xì)胞的生物特性將發(fā)生改變。在中細(xì)胞真核生物中，由于端粒酶的存在，使一些生物的端粒保持在一定的長(zhǎng)度范圍內(nèi)，且不隨生長(zhǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間而改變。這都表明在端粒長(zhǎng)度相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞中存在調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)度的機(jī)制。對(duì)于正常的豎脊肌細(xì)胞端粒保持一定的長(zhǎng)度，在腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛病變發(fā)展中，其端粒參與并且逐漸變短。結(jié)合試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，患者組端粒長(zhǎng)度明顯變短，44～49歲組比較短，29～34歲組其次。由此預(yù)見(jiàn)，骨骼肌細(xì)胞端粒變短可以作為作為腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛病變程度的指標(biāo)。
端粒酶是一個(gè)RNA蛋白質(zhì)復(fù)合物，RNA中含有指導(dǎo)DNA合成的模板序列，絕大多數(shù)正常體細(xì)胞不表達(dá)端粒酶活性，少數(shù)具有增殖潛能的細(xì)胞可以有低水平的端粒酶活性表達(dá)。骨骼肌細(xì)胞是由胚胎的生肌節(jié)和各處的間充質(zhì)細(xì)胞分化而成，在肌膜和基膜之間有一種體積較小的扁平或立方形細(xì)胞，稱為衛(wèi)星細(xì)胞，被認(rèn)為是保留在成年骨骼肌內(nèi)具有增殖分化能力的肌源性干細(xì)胞。一般情況，這些細(xì)胞位于肌膜和基底膜之間，保持不分裂、靜止?fàn)顟B(tài)。但是，當(dāng)肌細(xì)胞受到損傷刺激時(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞即被激活、增生并表達(dá)成肌細(xì)胞標(biāo)記物。后面這些細(xì)胞同原有的骨骼肌細(xì)胞相互融合，或是彼此融合，形成新的肌纖維細(xì)胞。腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征與其他部位的骨筋膜間隔綜合征病理變化相似，若得不到及時(shí)治療就會(huì)引起肌肉的變性、壞死及纖維化，在慢性骨筋膜間隔綜合征動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸材馨l(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)。這是腰肌重復(fù)性損傷形成的重要病理原因之一。因此推測(cè)，在腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征中，骨骼肌受到損傷，在損傷部位出現(xiàn)組織的變性和炎癥反應(yīng)同時(shí)，肌衛(wèi)星細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)。在肌肉發(fā)生損傷后24h內(nèi)，衛(wèi)星細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)，并且由于受到損傷刺激的影響，衛(wèi)星細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)了細(xì)胞核增大、DNA合成增加、細(xì)胞質(zhì)含量增多和細(xì)胞質(zhì)密度升高的現(xiàn)象，說(shuō)明衛(wèi)星細(xì)胞已經(jīng)被激活，并開(kāi)始表現(xiàn)出分裂利增殖，究其原因會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞端粒酶活性被激活、復(fù)制。在DNA復(fù)制過(guò)程中，由于聚合酶不能復(fù)制線性染色體的5’末端，每次細(xì)胞分裂時(shí)端粒DNA就會(huì)丟失50～200bp，引起端?？s短。
在實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者骨骼肌細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度7．099784～7．423502比較正常人端粒長(zhǎng)度8．29809～8．388441kb明顯縮短，并且具有顯著性差異（P＜0．05)。當(dāng)然端粒變短與端?；钚?，年齡等也有密切關(guān)系，其過(guò)程是復(fù)雜的。這對(duì)研究腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛、認(rèn)識(shí)其發(fā)病機(jī)制具有指導(dǎo)意義。同時(shí)也為臨床診斷腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛疾病的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，對(duì)其深入認(rèn)識(shí)尚有待于進(jìn)一步研究。