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內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激概述
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是哺乳動物細(xì)胞中一種重要的細(xì)胞器，其膜結(jié)構(gòu)占細(xì)胞內(nèi)膜的二分之一，是細(xì)胞內(nèi)其它膜性細(xì)胞器的重要來源，在內(nèi)膜系統(tǒng)中占有中心地位。ER的功能包括：
①ER是細(xì)胞的鈣儲存庫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子濃度高達(dá)5.0mmol/L，而胞漿中為0.1ummol/L。并能調(diào)節(jié)維持細(xì)胞內(nèi)鈣平衡。
②ER是分泌性蛋白和膜蛋白的合成、折疊、運(yùn)輸以及修飾的場所。ER通過內(nèi)部質(zhì)量調(diào)控機(jī)制篩選出正確折疊的蛋白質(zhì)，并將其運(yùn)至高爾基體，將未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)扣留以進(jìn)一步完成折疊或進(jìn)行降解處理。
③ER還參與固醇激素的合成及糖類和脂類代謝，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上含有固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白，對固醇和脂質(zhì)合成起調(diào)節(jié)作用。
ER對影響細(xì)胞內(nèi)能量水平、氧化狀態(tài)或鈣離子濃度異常的應(yīng)激非常敏感。當(dāng)細(xì)胞受到某些打擊（如缺氧、藥物毒性等）后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)氧化環(huán)境被破壞，鈣代謝失調(diào)，ER功能發(fā)生紊亂，突變蛋白質(zhì)產(chǎn)生或者蛋白質(zhì)二硫鍵不能形成，引起未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚以及鈣平衡失調(diào)的狀態(tài)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulumstress，ERS）。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)巨大的膜結(jié)構(gòu)為細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的反應(yīng)提供了一個廣闊的平臺，在許多信號調(diào)控中起到關(guān)鍵作用。近期的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中的重要環(huán)節(jié)。ERS可以介導(dǎo)與死亡受體和線粒體途徑不同的一條新的凋亡通路。當(dāng)細(xì)胞遭到毒性藥物、感染、缺氧等刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔未折疊蛋白增多和細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，引起caspase-12活化，繼而激活下游的caspase，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。早期的ERS是機(jī)體自身代償?shù)倪^程，對細(xì)胞具有保護(hù)作用；如果這種失衡超過了機(jī)體自身調(diào)節(jié)的能力，結(jié)局將是細(xì)胞的死亡。
ERS的確切機(jī)制目前尚不明確。深入研究ER及ERS，對于完善細(xì)胞損傷和凋亡理論具有重要意義，有助于進(jìn)一步認(rèn)識疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為臨床疾病預(yù)防和治療提供新的理博依據(jù)。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號通路
ER內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)一旦被打破，將激活一系列的級聯(lián)反應(yīng)通路，包括PERK/eIF2α通路、IRE1/XBP1通路及ATF6介導(dǎo)的通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的信號通路主要有：
①未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）；
②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)（endoplasmic reticulumoverload response，EOR）；
③固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)。其中UPR與EOR由蛋白質(zhì)加工紊亂所致，固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面合成的膽固醇損耗激發(fā)。
（1）UPR：
蛋白質(zhì)在ER內(nèi)的正確折疊需要許多分子伴侶的協(xié)助，當(dāng)ER中未折疊或錯誤折疊的蛋白增多時，應(yīng)激信號通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜傳遞到細(xì)胞核，繼而引起一系列特定的靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯水平下調(diào)，以使細(xì)胞繼續(xù)存活，這種反應(yīng)稱為未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）。UPR是一種細(xì)胞對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的自身保護(hù)機(jī)制，有利于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。
目前研究認(rèn)為，UPR至少包括4種機(jī)制：
Ⅰ.減弱翻譯能力，減少新蛋白合成，防止未折疊蛋白進(jìn)一步積聚；
Ⅱ.上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶等保護(hù)性基因的表達(dá)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78和GRP94，谷胱甘肽等基因增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊能力。
Ⅲ.使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化，提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)免疫調(diào)節(jié)和抗凋亡的能力。
Ⅳ.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，當(dāng)ER功能嚴(yán)重受累，機(jī)體以凋亡方式清除受損細(xì)胞以保護(hù)器官的功能。
UPR是一種機(jī)體對抗ERS的保護(hù)機(jī)制，通過引發(fā)ER內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白的正確折疊，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，來促使細(xì)胞功能恢復(fù)。但如果ERS過強(qiáng)或時間過長，則將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。IRE1、PERK、ATF6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的三種起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的跨膜蛋白，它們均對腔內(nèi)未折疊蛋白的聚集起作用。IRE1和PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白激酶，在沒有應(yīng)激情況下，和Grp78/Bip形成穩(wěn)定的復(fù)合物，而當(dāng)?shù)鞍族e誤折疊或未折疊蛋白增多時促使Grp78/Bip與其解離，然后IRE1和PERK的寡聚化及其自身磷酸化，刺激下游信號的激活。ATF6是含有bZip轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的Ⅱ型跨膜蛋白。當(dāng)未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集增多時，ATF6向高爾基體轉(zhuǎn)位，被S1P（site1 protease）和S2P酶切成p50 bZip轉(zhuǎn)錄因子到細(xì)胞核，并激活XBP1轉(zhuǎn)錄增加，導(dǎo)致UPR的活化。
（2）EOR
EOR是指正確折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上過度積聚時引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷，從而導(dǎo)致一系列信號物質(zhì)的激活，EOR也使機(jī)體自我保護(hù)性反應(yīng)之一。EOR效應(yīng)是激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。有研究顯示，EOR能被抗氧化劑和鈣拮抗劑所抑制；也能被促使鈣離子釋放的藥物所激活，因此推博EOR與鈣儲存釋放以及活性氧產(chǎn)生有關(guān)。
（3）固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上含有固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP），其無活性的前體大分子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜相連，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的固醇耗竭，導(dǎo)致SREBP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜結(jié)合的裂解，從而激活引導(dǎo)固醇生物合成的起動子，即固醇調(diào)節(jié)因子，引起脂肪酸和膽固醇的合成增加。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白增多或鈣失衡，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)信號，經(jīng)其膜上的三種跨膜蛋白激酶（IRE，PERK，ATF6）傳導(dǎo)到核內(nèi)，使編碼Bip等伴蛋白的基因表達(dá)增加，恢復(fù)蛋白質(zhì)正確構(gòu)像；eIF2α磷酸化可抑制蛋白質(zhì)翻譯，減少蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的堆積，從而對細(xì)胞起保護(hù)作用，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時間過長或強(qiáng)烈可活化繼而引起級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這是與死亡受體和線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡不同的一條途徑。
Caspase-12的激活與ERS
半胱天冬氨酸蛋白酶（Cysteme aspartate specific proteinase，caspase）是基因家族的表達(dá)產(chǎn)物，已發(fā)現(xiàn)這一家族至少有14個成員。這個家族包括一個含有半胱氨酸的五肽結(jié)構(gòu)，能在底物的N末端天冬氨酸殘基處裂解底物，從而通過蛋白水解激活或滅活底物蛋白對細(xì)胞凋亡起調(diào)節(jié)作用。caspase是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的主要酶類，絕大部分細(xì)胞凋亡依賴于caspase的存在。
Caspase-12是caspase家族中較新的成員，這個家族中也只有它定位于ER的成員，它的氨基端與Caspase-1和Caspase-11分別有39%和38%同源性。Caspase-12高水平表達(dá)在肌肉、腎、肝組織中，在腦組織中有適當(dāng)表達(dá)。Toshiyuki等將細(xì)胞破碎超速離心分為核、線粒體、微粒體（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜）、溶解碎片，經(jīng)免疫組織化學(xué)和western印跡證實(shí)caspase家族中僅caspase-12存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。正常生理情況下，caspase-12以無活性的酶原形式存在。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷可以特異地激活caspase-12酶原，使caspase-12發(fā)生重組，并與其它內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子協(xié)同作用切割并激活caspase-9酶原，繼之裂解caspase-3酶原等效應(yīng)caspase，效應(yīng)caspase切割多ADP聚合酶和其它細(xì)胞底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的實(shí)現(xiàn)。
國外學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，caspase-12在死亡受體或線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中不被活化。Caspase-12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡而其他死亡刺激仍可發(fā)生凋亡。這表明caspase-12與ERS介導(dǎo)的凋亡密切相關(guān)，與不涉及ER的凋亡信號通路無關(guān)。因此Caspase-12被譽(yù)為是介導(dǎo)ERS致凋亡通路的關(guān)鍵分子。
ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是不同于死亡受體及線粒體途徑的一種新的細(xì)胞凋亡途徑，caspase-12作為凋亡起始因子發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。有研究認(rèn)為ERS時，胞質(zhì)中的caspase-7自身活化，遷移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上切割caspase-12前體，產(chǎn)生活性caspase-12。
活化的caspase-12易位至胞漿中，活化下游的caspase，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這個過程可被caspase-12的抗體阻斷。
Caspase-12的激活主要通過以下幾種方式：
①鈣蛋白酶（calpain）的活化：calpain是胞質(zhì)中另一類半胱氨酸蛋白酶家族成員，其活化依賴于鈣離子的存在，在ERS時，ER鈣平衡打亂，細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高引起calpain活化，剪切定位于ER膜上的caspase-12前體，使之活化并釋放入細(xì)胞質(zhì)。
②TRAF2依賴性機(jī)制：在非應(yīng)激細(xì)胞中，TRAF2與caspase-12前體形成穩(wěn)定的復(fù)合物，而發(fā)生ERS時，caspase-12前體與TRAF2分離，引起caspase-12活化。
③caspase-7的轉(zhuǎn)位：ERS時使caspase-7移位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，與caspase-12形成復(fù)合物，并在Asp94和Asp341處切割caspase-12前體，破壞了膜與caspase-12的聯(lián)系，導(dǎo)致caspase-12活化并釋放于細(xì)胞質(zhì)。活化的caspase-12進(jìn)而直接激活caspase-9，而caspase-9可通過裂解caspase-3酶原等效應(yīng)caspase，切割多ADP聚合酶和多種其它細(xì)胞內(nèi)的底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
④GRP78，caspase-7，caspase-12。復(fù)合物途徑：近期研究表明，ERS誘導(dǎo)伴侶蛋白GRP78表達(dá)并重新分布于ER膜，與caspase-7和caspase-12形成復(fù)合物，阻止caspase-12從ER釋放，ATP的加入可解離這種復(fù)合物并促使caspase-12向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的活化的caspase-12啟動ERS反應(yīng)性凋亡級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在此過程中，caspase-12起了關(guān)鍵作用。鑒于Caspase-12在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的特殊位置，Caspase-12被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡的一個代表性分子。
ER的鈣穩(wěn)態(tài)
ER是細(xì)胞內(nèi)的鈣儲存庫。鈣離子是真核細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于身體各種組織中，并參與體內(nèi)眾多重要的生命活動，鈣穩(wěn)態(tài)在細(xì)胞的正常生理活動中起著舉足輕重的作用。在哺乳動物細(xì)胞中，ER鈣離子濃度高達(dá)5.0 mmol/L，胞漿中則為0.1ummol/L。ER通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的IP3通道釋放鈣離子到胞質(zhì)中，通過鈣泵將胞質(zhì)中的鈣攝入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，從而維持胞內(nèi)鈣的平衡。鈣在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)以鈣離子或鈣結(jié)合蛋白的形式存在。而鈣結(jié)合蛋白與蛋白質(zhì)折疊及修飾有關(guān)，ER的分子伴侶和折疊酶大多數(shù)是強(qiáng)力鈣離子結(jié)合蛋白。鈣離子作為信號轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮兩種作用：一是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔釋放入胞質(zhì)作為第二信使；二是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)調(diào)節(jié)鈣依賴蛋白酶的活性。所以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)對維持細(xì)胞的功能至關(guān)重要。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫受到嚴(yán)重干擾時，必然會影響這些蛋白質(zhì)的折疊和活性。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡是ERS的重要誘因。
有研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣失衡誘導(dǎo)ERS發(fā)生時，激活calpain?；罨腸alpain切割內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的caspase-12，產(chǎn)生活性caspase-12片斷；calpain還可切割bcl-XL，使其失活。研究證明，將caspase-12前體與鈣蛋白激酶一起在體外孵育，能夠產(chǎn)生caspase-12活性片斷，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。Nobu hiro將去除線粒體的小鼠成纖維細(xì)胞經(jīng)Thapsi gargin處理誘導(dǎo)ERS，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，caspase-12活化啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)；caspase-12的底物是caspase-9前體，并且caspase-9的活化不需線粒體釋放細(xì)胞色素C；凋亡信號從caspase-12傳到caspase-9再到caspase-3，caspase-3是效應(yīng)分子。Jimbo等研究顯示，用Thapgargin阻滯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣泵，干擾胞內(nèi)鈣的平衡，從而影響線粒體的能量代謝，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，與Apaf-1形成復(fù)合物，亦能活化caspase-9繼而引起細(xì)胞凋亡，因此鈣信號可能是線粒體途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)兩條通路的交點(diǎn)。Nakamura等也發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的鈣結(jié)合伴侶蛋白calreticulin可增加線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而增加Hela細(xì)胞對經(jīng)Thapgargin誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)致細(xì)胞凋亡的敏感性。
組織細(xì)胞在病毒感染、缺血、缺氧等因素作用下，都可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔鈣穩(wěn)態(tài)的改變，出現(xiàn)鈣剝奪或鈣超載，從而引起ER的功能紊亂。進(jìn)一步誘導(dǎo)未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蓄積，引起ERS進(jìn)而促使ER保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的產(chǎn)生。
鈣激活中性蛋白酶（calpain）是一族鈣離子依賴性的、水解半胱氨酸的蛋白酶。此家族由不同的半胱氨酸蛋白酶組成，并以多種異構(gòu)體形式在組織中廣泛表達(dá)，同時參與多種由鈣調(diào)節(jié)的細(xì)胞生理過程，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡。病理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的異常增高可使鈣蛋白酶活性增強(qiáng)，降解細(xì)胞骨架，膜蛋白以及各種激酶以及轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。calpain在細(xì)胞骨架重建、細(xì)胞循環(huán)調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡與壞死和胚胎發(fā)育等過程中有重要作用。在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)的鈣蛋白酶以無活性酶原的形式存在。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度異常增高時，calpain被激活，自身水解活化，從而誘導(dǎo)一系列的病理生理過程：
①選擇性降解細(xì)胞骨架蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞移行；
②裂解膜蛋白、磷酸酶和蛋白激酶等參與信號傳導(dǎo)；
③降解細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子如p53，c-jun等，對基因表達(dá)起調(diào)節(jié)作用；
④通過裂解caspase-3，6，7，12產(chǎn)生活性片段；裂解Bax等凋亡相關(guān)蛋白，介導(dǎo)凋亡。
在許多疾病中都發(fā)現(xiàn)了calpain活性的異常。如神經(jīng)損害性疾病，缺血與外傷性腦損傷、癌癥、肌營養(yǎng)不良、白內(nèi)障、中風(fēng)及糖尿病。還與腦、心臟及腎的缺血性損傷的細(xì)胞凋亡機(jī)制有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)calpain 3與肢帶型肌營養(yǎng)不良、calpain 9與腫瘤發(fā)生、calpain 10與Ⅱ型糖尿病的密切相關(guān)。在缺血和創(chuàng)傷性腦損傷時，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，直接激活calpain裂解細(xì)胞骨架成員，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡。
有關(guān)鈣蛋白酶誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的途徑可能有：
①線粒體途徑：細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加導(dǎo)致鈣蛋白酶激活，活化的鈣蛋白酶作用位于細(xì)胞質(zhì)中的凋亡相關(guān)蛋白Bid，直接降解Bid使其成為截?cái)嗟幕罨疊id，Bid與位于線粒體的跨膜蛋白Bak結(jié)合，促成Bak構(gòu)像改變，形成孔隙，使線粒體外膜的滲透性增加，線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
②蛋白水解途徑：鈣蛋白酶過度活動可導(dǎo)致細(xì)胞骨架、膜蛋白、各種激酶以及轉(zhuǎn)錄因子崩潰，如它可降解細(xì)胞骨架蛋白、血影蛋白、鈣調(diào)蛋白激酶和ADP核糖轉(zhuǎn)移酶等，結(jié)果細(xì)胞導(dǎo)致死亡。與caspases系統(tǒng)不同，鈣蛋白酶參與細(xì)胞壞死和凋亡兩種形式，并且在細(xì)胞死亡的后期與caspase有共同遵循的死亡途徑，而caspases僅能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
鈣蛋白酶抑制劑可分為兩大類，即內(nèi)源性抑制劑和外源性抑制劑。內(nèi)源性抑制因子calpastatin可以特異性地抑制μ鈣蛋白酶和m鈣蛋白酶的活性，具有熱穩(wěn)定性，能抵抗許多變性劑的作用。目前calpastatin的基因序列已經(jīng)被克隆，蛋白質(zhì)構(gòu)象分析證實(shí)，該蛋白保守區(qū)B約含30個氨基酸，與鈣蛋白酶區(qū)域Ⅱ結(jié)合，可能是起抑制作用的關(guān)鍵部位。calpastatin和鈣蛋白酶的結(jié)合需要鈣離子，并且這種結(jié)合是可逆的。鈣蛋白酶calpastatin系統(tǒng)的動態(tài)平衡是維持細(xì)胞正常生長和組織重建所必需的。外源性鈣蛋白酶抑制劑一般是體外合成的具有抑制鈣蛋白酶活性的肽復(fù)合物。其中Leupeptin是較為早期應(yīng)用的鈣蛋白酶抑制劑，它的特異性較低，而且對細(xì)胞膜的通透性不高。鈣蛋白酶抑制劑Ⅰ和Ⅱ是新合成的鈣蛋白酶抑制劑，特異性高于Leupeptin，而且在膜通透性面有很大改善。
Chen等采用出生3天的耳蝸培養(yǎng)模型觀察鈣蛋白酶抑制劑對組織缺氧、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏和藥物產(chǎn)生的耳蝸神經(jīng)毒性的影響，結(jié)果顯示鈣蛋白酶抑制劑Ⅰ、Ⅱ和Leupeptin均能保護(hù)耳蝸神經(jīng)元細(xì)胞，抵抗缺氧和神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡。Ding等的研究發(fā)現(xiàn)Leupetin能夠減低噪聲和氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致的耳蝸和前庭內(nèi)外毛細(xì)胞丟失，并且這種保護(hù)作用具有劑量依賴效應(yīng)。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露的耳蝸毛細(xì)胞有鈣蛋白酶的活動，Leupeptin能夠使噪聲導(dǎo)致的毛細(xì)胞丟失率降低60%。王蘋等的研究發(fā)現(xiàn)，leupeptin對離體培養(yǎng)的慶大霉素耳蝸損傷具有明顯保護(hù)作用，能夠阻斷65%螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡，從而推測在SGNs退行性死亡的過程中可能有鈣蛋白酶的活動。Squier在胸腺細(xì)胞的凋亡模型中證實(shí)有calpain的激活，且calpain抑制劑可以抑制胸腺細(xì)胞的凋亡。Kawamura等的實(shí)驗(yàn)觀察到calpain抑制劑MDL-28170能夠抑制細(xì)胞壞死和凋亡而對未成熟大鼠缺氧缺血性腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，calpain抑制劑1可以明顯抑制大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，SquieR等在糖皮質(zhì)激素和輻射誘導(dǎo)的胸腺不成熟T細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)calpain參與了細(xì)胞凋亡，應(yīng)用calpain抑制劑阻止了胸腺細(xì)胞的凋亡。calpain抑制劑可以降低癌癥的病變程度，改善和提高正常組織的功能，calpain抑制劑還能預(yù)防心臟、腦、肝及腎細(xì)胞的缺血性細(xì)胞凋亡。但迄今為止，對于calpain及抑制劑在藥物性耳聾方面的研究少。
ER鈣穩(wěn)態(tài)失衡是ERS的一個早期事件，若能及早穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣水平，就可能抑制和消除UPR。calpain可能是這些疾病的一個理想的治療靶點(diǎn)，因此，對于calpain及其抑制劑的深入研究對疾病的治療具有重要意義。
ERS與細(xì)胞凋亡
（1）細(xì)胞凋亡的途徑
細(xì)胞凋亡是機(jī)體正常組織細(xì)胞在受到生理和病理性刺激后出現(xiàn)的、按一定程序發(fā)生的自發(fā)性死亡，細(xì)胞凋亡對組織分化、器官發(fā)育、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)具有非常重要的意義。細(xì)胞凋亡是一個信號依賴的過程，可由多種因素誘導(dǎo)，如藥物、缺氧、病毒感染等。細(xì)胞凋亡可以被多種生理性、病理性刺激誘發(fā)，其過程在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為胞質(zhì)濃縮、核染色質(zhì)凝縮、DNA大規(guī)模斷片化、細(xì)胞膜內(nèi)陷并發(fā)泡形成凋亡小體。目前研究認(rèn)為，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞凋亡中起著重要的調(diào)節(jié)作用。
細(xì)胞凋亡的信號途徑有：
①線粒體相關(guān)的內(nèi)源性凋亡途徑：
線粒體主要由基質(zhì)、內(nèi)膜、外膜和膜間隙組成。內(nèi)膜含有ATP合酶、電子傳遞鏈、腺苷酸轉(zhuǎn)位子，生理?xiàng)l件下，這些分子維持電化學(xué)梯度；外膜含有電壓依賴的陰離子通道；膜間隙含有細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cytc），Caspases酶原、腺苷酸激酶和凋亡誘導(dǎo)因子。線粒體的膜通道是細(xì)胞凋亡線粒體途徑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。細(xì)胞在各種凋亡信號的刺激下，鈣離子引起線粒體損傷，細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞漿中，這是內(nèi)源性途徑關(guān)鍵的一步；釋放到細(xì)胞漿中的細(xì)胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1（Apaf 1）結(jié)合，從而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)。Bcl 2家族參與這一通路引起細(xì)胞凋亡的調(diào)控。
②死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑：
死亡受體（DR）是屬于腫瘤壞死因子（TNF）家族成員之一。該家族共有八個成員，其中Fas、DR3、TNFR等尤為典型。DR家族有其共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)含有與死亡信號有關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域；當(dāng)配體與死亡受體結(jié)合后，將吸引接頭蛋白（TRADD，F(xiàn)ADD）并募集Caspase-8，10的前體形成凋亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，啟動Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
③ERS相關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑：
近期的報道顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個新的細(xì)胞凋亡始動靶點(diǎn)，能通過caspase-12、PERK/CHOP和JNK途徑介導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。在某些理化因素的作用下，可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引起細(xì)胞凋亡。傳統(tǒng)觀點(diǎn)都把單獨(dú)的線粒體途徑凋亡作為內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的主要原因。但目前的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體在細(xì)胞凋亡之間存在著重要的關(guān)聯(lián)，而鈣離子可能是兩條途徑間的相互聯(lián)系的信號分子。Tian等通過實(shí)驗(yàn)證明，某種凋亡刺激因素使Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放，然后引起線粒體通透孔的形成和線粒體內(nèi)Ca2+超負(fù)荷，線粒體膨脹，其結(jié)果是線粒體外膜破裂，膜間隙中的促凋亡蛋白流入細(xì)胞質(zhì)中，因而線粒體的凋亡途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及Ca2+是密切相關(guān)的。同時也有報道，在ERS反應(yīng)性凋亡過程中發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞色素C從線粒體釋放，表明在特定的細(xì)胞類型中ERS反應(yīng)性凋亡途徑與線粒體凋亡途徑可能存在聯(lián)系。細(xì)胞凋亡畢竟是一個有許多分子參與的復(fù)雜而有序的過程。
（2）ERS致細(xì)胞凋亡的機(jī)制
ERS致細(xì)胞凋亡的分子轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制目前還不明確。根據(jù)近年來的研究進(jìn)展，可能通過如下機(jī)制引起細(xì)胞凋亡：
1．Caspase-12活化啟動細(xì)胞凋亡
Caspase-12在ERS細(xì)胞凋亡途徑中作為起始因子發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞漿面，以前體形式存在，僅特異地被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號通路水解活化。將活化的Caspase-12導(dǎo)入細(xì)胞，該細(xì)胞很快發(fā)生凋亡；而caspase-12敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞能抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡。Caspase-12的激活機(jī)制有：
①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣異常：
ER鈣平衡的紊亂能夠直接激活caspase-2，激活的caspase-12進(jìn)一步激活caspase-9，caspase-9激活下游的caspase-3進(jìn)入細(xì)胞凋亡的通路。但caspase-12對caspase-9的激活不依賴線粒體凋亡途徑成分Apaf 1和細(xì)胞色素。有研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣失衡時，激活鈣蛋白酶（calpain）?；罨拟}蛋白酶切割內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的caspase-12，產(chǎn)生活性caspase-12片段，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)caspase-7移位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，在caspase-7存在的條件下，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的caspase 12可被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所激活而引發(fā)細(xì)胞凋亡。
但Xie等研究發(fā)現(xiàn)caspase-12的活化與caspase-7及caspase-3的進(jìn)程一致，認(rèn)為caspase-12活化的主要機(jī)制不是caspase-7的活化，而是與細(xì)胞鈣離子平衡失調(diào)有關(guān)。
②IRE1-TRAF2復(fù)合物：
在UPR過程，IRE1-α招募TRAF2，其復(fù)合物促使caspase-12酶原聚集和活化。
2．促凋亡編碼基因CHOP的激活
CHOP廣泛表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞，與各種細(xì)胞活動（如能量代謝、增殖、分化、凋亡）相關(guān)。正常情況下，CHOP表達(dá)十分低，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時，其表達(dá)顯著增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Ji等通過對CHOP野生型小鼠和CHOP缺陷型小鼠灌喂酒精的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CHOP野生型小鼠的肝細(xì)胞發(fā)生了凋亡，一些與凋亡相關(guān)基因也出現(xiàn)了變化，如Gadd45與組織蛋白酶B的上調(diào)和Jun-D與Bcl-xl的下調(diào)，而這些在CHOP缺陷型小鼠中并未觀察到，進(jìn)一步說明了CHOP基因在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的重要作用，但其分子機(jī)制并不清楚。Ohoka等研究發(fā)現(xiàn)，CHOF-TRB3途徑可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起作用。TRB3是CHOP的作用靶點(diǎn)之一，作為CHOP的調(diào)節(jié)子，通過負(fù)反饋機(jī)制調(diào)節(jié)CHOP信號通路，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激比較短暫或輕微，TRB3能通過與CHOP/ATF4的結(jié)合而使其失去功能，但持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將導(dǎo)致TRB3過表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
3．IRE1-JNK信號途徑
盡管JNK對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的作用還不清楚，但Gu等研究認(rèn)為細(xì)胞經(jīng)敲除蛋白酪氨酸磷酸酶1B后，不能激活I(lǐng)RE1-JNK途徑而抵抗細(xì)胞的凋亡。ERS激活I(lǐng)RE1s后，招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-2（TNF recepto Rassociated factor 2，TRAF2），TRAF2激活凋亡信號調(diào)節(jié)激酶-1（apoptosis signal regulation kinase 1，ASK1），結(jié)果引起MKK/NK途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。新研究證明，缺乏calpain的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞能抵抗毒胡蘿卜素和衣霉素誘導(dǎo)的凋亡。而這種抵抗作用又與caspase-12、9、3級聯(lián)活化和ASK1/MKK4/JNK/C-Jun級聯(lián)活化的缺陷有關(guān)，因此calpain對JNK的激活具有重要作用。
結(jié)語
綜上所述，根據(jù)近年來的研究資料，各種原因?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起未折疊蛋白的蓄積或Ca2+穩(wěn)態(tài)的失衡，均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，并通過激活其膜上的三個跨膜蛋白激酶而轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)信號至細(xì)胞核。引起具有高度保守的自我保護(hù)信號通路的激活，以促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的蛋白折疊和減少蛋白的合成，進(jìn)而促使細(xì)胞的功能恢復(fù)。但程度過強(qiáng)或時間過長的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將誘導(dǎo)凋亡啟動因子Caspase-12的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。ERS與很多因素所致疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，常見有神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病、化學(xué)藥物毒物中毒、糖尿病、腫瘤和病毒感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展及細(xì)胞凋亡都密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是不同于死亡受體及線粒體途徑的一種新的細(xì)胞凋亡途徑，因此對ERS作用機(jī)制的深入研究，可使我們進(jìn)一步加深對疾病細(xì)胞生物學(xué)自我調(diào)控的了解。根據(jù)引發(fā)ERS的機(jī)制及其自我調(diào)控機(jī)制，探尋疾病治療的新靶點(diǎn)。以期對疾病采取一些有效的預(yù)防和治療措施。隨著研究的逐步深入，相信在國內(nèi)外學(xué)者的共同努力下，會取得突破性的進(jìn)展。