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周崧易靜
《細胞生物學(xué)雜志》2006年05期
【作者單位】：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)教研室
【摘要】：
活性氧(reactive oxygen species，ROS)是生物體內(nèi)一類活性含氧化合物的總稱，主要包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等。細胞內(nèi)有多種部位能生成ROS，主要包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、NADPH氧化酶復(fù)合體、脂氧合酶系、環(huán)氧合酶系等。靜息條件下，細胞內(nèi)ROS的水平被控制在很低的范圍。而在細胞受到各種生理或病理因素作用時，當(dāng)多種細胞外信號分子作用于其膜受體，ROS生成可以受到受體活化的誘導(dǎo)而“有目的”地快速增加，從而作為細胞內(nèi)信號分子參與細胞增殖，分化和凋亡等各種細胞行為。
活性氧(reactive oxygen species，ROS)，特別是諸如超氧陰離子(O2·-)、羥自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)，作為生命體有氧代謝的中間產(chǎn)物，多年來主要被看作對大分子有損傷作用的毒性物質(zhì)。ROS對細胞有益的概念先是被作為動物機體防御系統(tǒng)的重要組成部分而提出的，早期的工作重的重要組成部分而提出的，早期的工作重點主要集中在中性粒細胞等吞噬細胞的呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的ROS作為毒性分子對病菌的殺傷上，同時也涉及細胞內(nèi)高濃度ROS的生成對細胞的殺傷作用。然而，研究證明，ROS有作為細胞內(nèi)信號分子所擁有的各種特性，如：
(1)當(dāng)細胞受特定刺激，或受到細胞外信號分子如配體激發(fā)時能快速生成；
(2)能在細胞內(nèi)快速擴散；
(3)生成后能引起該細胞或臨近細胞的特定行為；
(4)在需要關(guān)閉或復(fù)原時能通過多種途徑迅速移除信號；等等。
近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ROS作為一種重要細胞內(nèi)信號分子參與了細胞增殖、分化和凋亡，以及許多重要的細胞行為。ROS在靜息細胞內(nèi)的生成速率主要受到生成部位的代謝狀態(tài)和氧還狀態(tài)的制衡，此時細胞內(nèi)ROS被控制在一個很低的范圍內(nèi)，一旦細胞受到相關(guān)配體信號激發(fā)，往往伴隨著細胞內(nèi)ROS水平的迅速提升，繼而產(chǎn)生細胞內(nèi)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。現(xiàn)就目前BOS在細胞內(nèi)的生成部位以及受到細胞外信號分子誘導(dǎo)后ROS的生成機制的研究進展進行簡要論述。
1細胞內(nèi)ROS的生成部位
細胞內(nèi)ROS主要依賴細胞質(zhì)膜和內(nèi)膜上氧化酶生成。原則上，任何涉及電子傳遞的蛋白質(zhì)或酶系都能導(dǎo)致“副產(chǎn)物”ROS的生成。由于細胞內(nèi)強大的還原系統(tǒng)的存在，大多數(shù)非“目的性”生成的ROS多被立即清除以保持胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡。
1．1呼吸鏈
線粒體是細胞內(nèi)很大的ROS產(chǎn)地。在胞內(nèi)還原環(huán)境下，大約有1%～2%的O2耗在呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ處被漏出的電子還原成為ROS也就是說，線粒體的電子漏是細胞內(nèi)ROS的主要來源。但是由于線粒體內(nèi)高濃度的SOD存在，以及生成的O2·-其自身擴散出膜能力差，只有少量形成的H2O2擴散入胞漿，胞漿ROS水平被控制在一個低而穩(wěn)定的水平。
過去對這部分ROS參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并不重視，近來有證據(jù)顯示TNF-α和IL-1介導(dǎo)的細胞凋亡為線粒體源ROS所調(diào)控。TNF-α能激活細胞線粒體生理性解偶聯(lián)機制，通過使連接呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ的CoQ半醌形式（QH）穩(wěn)定性增加，從而增加ROS生成、促進線粒體腫脹以及細胞色素c釋放，導(dǎo)致細胞凋亡。另外，有報道提出在受抗原刺激下擴增T細胞的凋亡過程存在兩條途徑，分別為活化誘導(dǎo)的細胞死亡（activation-inducedcell death AICD）和活化T細胞的自發(fā)死亡(activated T-cell autonmnousdeath ACAD)，這兩條途徑都有可能受到線粒體源的ROS所調(diào)控。
在對心肌細胞缺血再灌的研究中發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)產(chǎn)生的高濃度ROS能通過PKC和MAPK途徑誘導(dǎo)蛋白酪氨酸磷酸酶（proteintyrosine phosphotasa PIP）持續(xù)激活使線粒體腫脹，而細胞通過線粒體體積依賴型和非依賴型兩條途徑抑制糖原合成激酶-3β（GSK-3β)的合成，提高了細胞對ROS的敏感閾從而起到保護細胞的作用。
線粒體作為氧感受器介導(dǎo)缺氧所誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄也需要ROS參與。新近有研究顯示，在整合素介導(dǎo)的細胞信號中，線粒體來源的ROS能啟動細胞分化，起到抗凋亡的作用。
1．2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）
ER是細胞內(nèi)另一個生成ROS的膜性細胞器。不同于線粒體，ER中的細胞色素P-450和b5家族通過氧化不飽和脂肪酸和外源生化物質(zhì)來生成O2-/H2O2。雖然鮮有關(guān)于ER生成的ROS和細胞信號之間直接聯(lián)系的報道。但有研究證明了ROS能通過改變非受體型酪氨酸激酶活性等途徑影響到ER諸如蛋白質(zhì)折疊和分泌等的功能。在研究TNF-β介導(dǎo)肝細胞凋亡過程中也發(fā)現(xiàn)線粒體和ER細胞色素P-450 1A1生成的ROS共同參與凋亡的細胞信號過程。
1．3 NADP源化酶復(fù)合體
結(jié)合在細胞質(zhì)膜上的NADPR氧化酶復(fù)合體是生成ROS的另一個重要部位，也是目前研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)生長因子和激酶激發(fā)的ROS生成部位。早對于NADPH氧化酶的研究是基于吞噬細胞的呼吸爆發(fā)，其復(fù)合體是由質(zhì)膜上的p22phox、gp91phox組成的細胞色素b558復(fù)合體和胞漿中的磷酸化的p47phox、p67phox和p40phox組成，上述成分與兩個激活后由GTP結(jié)合的G蛋白p21Rac和Rap1A組裝成活化的氧化酶，產(chǎn)生ROS。
近年來，不斷發(fā)現(xiàn)在成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、腎系膜細胞、甲狀腺細胞等非吞噬細胞內(nèi)，存在與吞噬細胞NADPH氧化酶類似的、具有氧化活性的酶，這些酶被叫做Nox。在非吞噬細胞內(nèi)，ROS的生成遠低于吞噬細胞，常常都顯示對細胞增殖、分化的誘導(dǎo)作用，說明ROS在此扮演是細胞內(nèi)信號分子的角色。目前認為非吞噬細胞內(nèi)的ROS生成量低是由于其NADPH氧化酶組成成分的低表達，特別是Nox的含量，大約只有白細胞的1%～3％所致。這些NADPH氧化酶胞質(zhì)成分與吞噬細胞內(nèi)的相同，而其主要的活性反應(yīng)中心細胞色素b558的β亞基gp91phox則存在多種類似物，由于它們功能和結(jié)構(gòu)相近，如都含數(shù)個穿膜片段、上有含參與電子傳遞的Fe離子的血紅素結(jié)合位點、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域有FAD和NADPH結(jié)合位點，已被歸類為Nox家族，目前發(fā)現(xiàn)的有Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5以及Duox亞族（圖1）。
1．3．1 Nox2
Nox2(Aka，gp91phox)即白細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的gp91phox，其結(jié)構(gòu)為一個主要由6個疏水穿膜片段串連而成的大小為91 kDa的糖蛋白，其中胞質(zhì)端為結(jié)合FAD、NADPH的保守位點，電子則由蛋白質(zhì)中心的2個血紅素傳遞給胞外的氧分子以生成O2-。
1．3．2 Nox1
Nox1（Vbx-1，NOH-1）在人結(jié)腸中高表達，在前列腺、子宮和血管平滑肌內(nèi)次之，與Nox 2有56％的同源性。在血管平滑肌組織中，Nox1在增殖細胞中的表達要遠高于靜止期細胞，并且其表達受到PDGF、ANGⅡ、PGF2α等生長因子的調(diào)控，可以推測Nox1與細胞生長以及成血管信號放大有關(guān)。新研究表示，雖然在結(jié)腸腫瘤組織中存在Nox1的高表達，但尚無證據(jù)表明其與腫瘤細胞的增殖有關(guān)，可能Nox1在結(jié)腸上皮細胞分化中起了其他的作用。
1．3．3 Nox3
Nox3（gp91-3）mRNA過去只被發(fā)現(xiàn)在某些胎兒組織，如腎臟、腦以及頭骨處表達，其結(jié)構(gòu)與Nox2有58％的同源性。新近研究發(fā)現(xiàn)，Nox3在內(nèi)耳道前庭以及耳蝸上皮細胞內(nèi)表達。體外實驗發(fā)現(xiàn)在p47phox、p67phox，或在直腸NADPH氧化酶Nox組織物1(Nox organizer 1)和Nox激活物1（Nox activator1)的存在下，Nox3能產(chǎn)生高濃度的ROS推測與耳毒性藥物導(dǎo)致聽力損傷的病理機制有關(guān)。
1．3．4 Nox4
Nox4（Renox Kox-1，Kox)存在于人腎皮質(zhì)，特別是遠端小管上皮細胞和系膜細胞內(nèi)，與Nox2有39%同源性。近期大量研究表明Nox4作用可能是作為氧感受器調(diào)節(jié)EPO的合成以及腎臟細胞的生長和凋亡。對于Nox4的腎外作用，Yang等回發(fā)現(xiàn)Nox4和Nox2存在于小鼠破骨細胞中，可能為骨質(zhì)重吸收提供一個氧化環(huán)境。
1．3．5 Nox5
Bbx5在睪丸精原細胞以及在淋巴細胞豐富的脾臟和淋巴結(jié)內(nèi)表達。其結(jié)構(gòu)為一種Ca2+激活的gp-91phox蛋白類似物，但僅與NOX2有27%的同源性。其功能除了被鈣激活生成ROS外，還能作為質(zhì)子通道平衡胞內(nèi)外電位差和pH值。目前主要觀察到Nox5與精原細胞成熟，如人精子活力及頂體反應(yīng)的氧化改變有關(guān)。另外，在脾臟中，Nox5可能是T、B細胞被激活后產(chǎn)生ROS的部位，介導(dǎo)了T、B細胞的增殖分化。
1．3．6 Duox亞族
Duox亞族包括Duox1(Thox1）和Duox2(Thox2，p138TOX)，分別存在于甲狀腺、小腸和結(jié)腸中，人類Duox1和Duox2序列有83%相同。在人甲狀腺濾泡中，Duox存在于濾泡細胞尖端表面，因此可能其功能與甲狀腺過氧化酶介導(dǎo)的碘化反應(yīng)及甲狀腺球蛋白的酪氨酸殘基的交聯(lián)有關(guān)。Duox2突變造成先天性甲減證明Duox2在甲狀腺素的合成中起到重要的作用，而Duox1在甲狀腺組織中的作用目前還不明確。在人的腮腺導(dǎo)管、結(jié)直腸黏液腺和主要氣道壁的黏液腺上也存在Duox，可能其產(chǎn)生的H2O2與乳酸過氧化酶的抗菌作用有關(guān)。
1．4脂氧合酶系、環(huán)氧合酶系
脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)和環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）是細胞脂類代謝中將花生四烯酸代謝為脂類過氧化物和ROS的酶類。目前作為細胞信號研究的主要是COX-1、COX-2、5-LOX和12-LOX。它們生成的ROS以及活性氮(RNS)，單獨或共同通過多種信號途徑參與改變細胞葡萄糖攝取、受體活性和細胞因子釋放等活動，終可導(dǎo)致細胞死亡。比如，白介素IL-1β在類淋巴細胞激活NF-κB的過程依賴5-LOX產(chǎn)生的ROS。Chiarugi等也發(fā)現(xiàn)參與細胞黏附過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的ROS是由LOX生成的，而非先前認為的由NAPDH氧化酶生成。
1．5其他
另外，核膜上的細胞色素氧化酶系和電子傳遞系統(tǒng)類似于ER膜上的，也能生成ROS。但是據(jù)現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，核膜電子漏出所產(chǎn)生的ROS對細胞DNA有破壞作用。還有包括γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系等酶都能產(chǎn)生ROS，但至今還缺乏關(guān)于它們參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的直接證據(jù)。
2信號配體誘導(dǎo)的ROS生成
所有的多細胞生物都是通過一個由胞外和胞內(nèi)信號組成的高度復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)來控制其一系列的生物學(xué)行為，包括生長發(fā)育消亡、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、組織損傷的修復(fù)等等。細胞外信號通常包括物理性和化學(xué)性兩類。所謂化學(xué)性的細胞外信號主要指細胞因子、生長因子、激素和神經(jīng)遞質(zhì)等。這些信號就是作為配體通過激活細胞表面或細胞內(nèi)的特異性受體見下述)，進而激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起到調(diào)控細胞行為的作用。在此過程中細胞內(nèi)ROS快速而一過性升高，與配體-受體相互作用緊密偶聯(lián)，往往對后繼的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生介導(dǎo)和調(diào)控作用。
2．1 TNF-α受體
TNF-α受體在被TNF-α激活后引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中生成ROS的現(xiàn)象得到大量報道。關(guān)于TNF-α的研究發(fā)現(xiàn)，由TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS能激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及其基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化；另一方面，TNF-α介導(dǎo)的細胞凋亡的死亡信號傳遞過程中，caspase-3也能激活線粒體外膜通透性改變、細胞色素c釋放和ROS生成從而對整個凋亡過程起到反饋放大的作用。
目前關(guān)于TNF-α膜受體激活線粒體產(chǎn)生ROS的具體機制仍不明確。有報道說，L929細胞TNF-αR55受體在激活后其膜內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域能誘導(dǎo)線粒體向核周易位和聚集，從而介導(dǎo)細胞凋亡。另外，配體激活后能在胞漿內(nèi)連接TNFR并誘導(dǎo)其三聚化的TNF受體聯(lián)系因子(TRAF2)和受體相互作用蛋白（RIP），為ROS生成和TNF的信號的必須效應(yīng)分子。
2．2酶聯(lián)受體
2．2．1受體酪氨酸激酶(receptortyrosine kinase，RTK）
很多生長因子結(jié)合的RTK都能激活ROS生成，通過對胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的加強或氧還狀態(tài)的改變影響細胞內(nèi)主要的MAPK途徑。其中研究比較早的是血小板來源的生長因子（PDGF）和上皮生長因子（EGF）受體。Sundaresan等在報道了PDGF通過提高胞內(nèi)H2O2水平誘導(dǎo)酪氨酸磷酸化，從而啟動MAPK信號途徑的機制。Bae等報EGF受體激酶參與了EGF介導(dǎo)的胞內(nèi)H2O2生成，他們否定了先前EGF受體自磷酸化的理論，闡述了是H2O2通過抑制PTP活性間接激活生長因子受體激酶即RTK活性的。Kamata等也闡述了EGF受體的二聚化或寡聚化依賴H2O2對PTP的抑制的類似觀點。
近年來的研究發(fā)現(xiàn)，很多生長因子受體誘導(dǎo)ROS生成的同時胞內(nèi)Rac1/Ras水平也相應(yīng)升高，而Rac1能通過GTP獲能后與NADPH氧化酶的關(guān)鍵部分p67phox結(jié)合，從而激活NADPH氧化酶生成ROS。因此，生長因子受體自己被激活后通過Rac1激活NADPH氧化酶生成ROS，從而將信號往下游轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前的研究還發(fā)現(xiàn)Rac1活性能通過不同細胞內(nèi)存在的前饋和反饋機制被放大或關(guān)閉，該機制受細胞內(nèi)氧還狀態(tài)調(diào)控。另外，也有報道稱整合素能通過Rac GTPase誘導(dǎo)線粒體HOS生成以改變細胞形態(tài)，調(diào)控細胞凋亡。目前也有研究表明5-LOX生成ROS是Rac-1介導(dǎo)的又一條細胞信號途徑。
2．2．2受體絲氨酸/蘇氨酸激酶(receptor serine/threoninekinase，RS/TK）
目前在哺乳動物細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的所有RS/TK都屬于TGF超家族，它們的作用機制都是通過Ⅰ型和Ⅱ型受體的異源復(fù)合體磷酸化激活SMAD蛋白和由該蛋白質(zhì)介導(dǎo)的細胞信號途徑。目前，已證明有很多細胞在TGF-β1刺激下有ROS生成，并產(chǎn)生多種效應(yīng)，而ROS的來源可能不是膜上NADPH氧化酶。不同于RTK偶聯(lián)的生長因子，大多數(shù)TGF-β1都抑制其靶細胞的生長。Shibanuma等報道，在TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠成骨細胞在分化過程中的生長抑制和DNA合成減少需要H2O2介導(dǎo)。不過，TGF受體作用生成ROS的直接靶點至今仍未被找到。
2．2．3 G-蛋白偶聯(lián)受體
細胞表面受體中大部分就是G-蛋白偶聯(lián)受體，其中有很多被發(fā)現(xiàn)能介導(dǎo)ROS生成，例如血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)、5羥色胺(5-HT)、血栓素、內(nèi)皮素（ET）等的受體。
在血管平滑肌細胞中發(fā)現(xiàn)ANGⅡ能誘導(dǎo)NADH/NADPH氧化酶依賴的ROS生成，并且此事件與高血壓有關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)依賴ANGⅡ的ROS生成在生理上能產(chǎn)生多種作用，包括血管收縮、血管平滑肌細胞肥大、細胞存活激酶Akt/PKB的激活、胰島素樣生長因子-1受體的激活和IL-6的生成等。類似過程也見于5-HT。5-HT在血管平滑肌細胞能誘導(dǎo)依賴NADPH氧化酶的ROS生成，而且這種ROS生成是5-HT激活MAPK、誘導(dǎo)基因表達的上游事件。
2．2．4離子通道偶聯(lián)受體
神經(jīng)元快速電興奮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過突觸離子通道快速的開放和關(guān)閉實現(xiàn)的，而離子通道偶聯(lián)受體的配體大多為神經(jīng)遞質(zhì)（乙酰膽堿、5-HT、谷氨酸、α-氨基丁酸等)。目前發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元細胞內(nèi)谷氨酸能誘導(dǎo)ROS生成，其機制可能有依賴胞內(nèi)離子濃度途徑和非依賴胞內(nèi)離子濃度途徑兩種。有報道說該過程是由胞內(nèi)Zn2+介導(dǎo)的線粒體去極化，細胞色素c大量釋放使ROS濃度上升導(dǎo)致。在心肌細胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿能激活K-ARP通道開放和線粒體ROS生成以作為細胞信號介導(dǎo)心肌細胞缺血前適應(yīng)，然而一旦缺血造成過量ROS生成又將誘導(dǎo)心肌細胞的死亡。
3小結(jié)
綜上所述，信號配體作用于細胞時往往誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS快速生成，ROS的來源以質(zhì)膜NADPH氧化酶為多見，產(chǎn)生的ROS隨即介導(dǎo)了相應(yīng)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)是由配體受體相互作用以及不同信號途徑的相互作用[或稱“串話”（crosstalk）]決定的，但ROS常常參與調(diào)控該信號途徑自身轉(zhuǎn)導(dǎo)和與其他途徑的“串話”，從而對結(jié)局施加影響。得益于技術(shù)手段的飛速發(fā)展，ROS在細胞內(nèi)介導(dǎo)細胞增殖分化以及凋亡信號途徑的細節(jié)正在逐步被闡明，某些研究成果也對心血管疾病、糖尿病的治療起到一定的指導(dǎo)作用。但是目前臨床上更多的仍是將高濃度ROS作為一種組織毒性分子對待而予以消除。相信隨著人們對于ROS生成的目的性、特異性以及生成時機、生成量的調(diào)控等問題的了解增多，ROS作為細胞內(nèi)重要的信號分子將得到更為全面和正確的認識。