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李載權(quán)周愛(ài)儒唐朝樞
【作者單位】：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系
《中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)》2004年03期
【摘要】：
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是導(dǎo)致心腦組織缺血梗塞、神經(jīng)退行性疾病等發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。目前發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸、氧化應(yīng)激、鈣代謝紊亂等都能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激級(jí)聯(lián)反應(yīng)，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)合成暫停、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡等。這些表現(xiàn)包括在未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)、整合應(yīng)激反應(yīng)(ISR)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡(ERAD)三個(gè)相互關(guān)聯(lián)的動(dòng)態(tài)過(guò)程中，每一過(guò)程的分子機(jī)理現(xiàn)已逐步被揭示。作為細(xì)胞保護(hù)性應(yīng)對(duì)機(jī)制的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激體系一旦遭到破壞，細(xì)胞將不能合成應(yīng)有的蛋白質(zhì)，亦不能發(fā)揮正常的生理功能，甚至?xí)霈F(xiàn)細(xì)胞凋亡。掌握內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程對(duì)進(jìn)一步理解多種疾病的發(fā)生機(jī)理有十分重要的理論意義。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是哺乳細(xì)胞中一種重要的亞細(xì)胞器。膜/分泌性蛋白、氨基多糖、磷脂、膽固醇及鈣信號(hào)等的代謝均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能直接相關(guān)，例如分泌性蛋白的合成與空間折疊、蛋白質(zhì)糖基化修飾、蛋白質(zhì)分泌等均在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)發(fā)生。目前研究認(rèn)為，胰腺細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙可能分別是糖尿病、心腦組織缺血梗塞、退行性神經(jīng)疾病等發(fā)生的重要原因。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoptasmic reticulum stress，ERS)是指由于某種原因使得細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細(xì)胞器病理過(guò)程，如蛋白質(zhì)不能正確折疊。同樣，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中某一生理功能發(fā)生障礙如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣流失或鈣超負(fù)荷，蛋白質(zhì)糖基化形成障礙或蛋白質(zhì)不能形成正常的二硫鍵等也可反過(guò)來(lái)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，一般是用未折疊蛋白來(lái)提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)。正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是實(shí)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的基本條件，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有很強(qiáng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)體系。盡管如此，但仍然有很多因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。例如缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)等化學(xué)物質(zhì)處理、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成過(guò)快以至于超過(guò)蛋白折疊能力、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝紊亂、卵磷脂合成障礙等多種物理、化學(xué)或遺傳因素等都可成為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要誘因。此外，氨基酸剝奪、砷中毒、熱休克等細(xì)胞應(yīng)激和線粒體鈣超載都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有十分密切的聯(lián)系，這些縱橫交錯(cuò)的關(guān)系共同組成了復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)體系。
1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期蛋白質(zhì)合成暫停
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白的堆積等，其中由蛋白質(zhì)堆積所引起的一系列后續(xù)反應(yīng)稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。未折疊蛋白反應(yīng)先表現(xiàn)為蛋白質(zhì)合成暫停，隨著應(yīng)激反應(yīng)蛋白基因表達(dá)，可進(jìn)一步改善細(xì)胞生理狀態(tài)。但當(dāng)應(yīng)激原強(qiáng)度超過(guò)細(xì)胞自身處理能力時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也會(huì)誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)性細(xì)胞凋亡通路，以消除受損又不能及時(shí)修復(fù)的細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有一套完整的監(jiān)測(cè)、應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的體系，因此，所有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)實(shí)際上是一種細(xì)胞水平上的保護(hù)性手段(見(jiàn)Fig．1)。
1983年Brostrom發(fā)現(xiàn)，將鈣離子添補(bǔ)到預(yù)先剝奪鈣離子的細(xì)胞培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)該細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成速度比補(bǔ)加鈣離子前明顯增加，起初他們認(rèn)為蛋白質(zhì)合成可能是一需胞漿鈣離子參與的過(guò)程，隨后他們加入一種能促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子向胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)的工具試劑thapsigargin(TG，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵Ca2+，Mg2+-ATPase抑制劑，現(xiàn)常用來(lái)制備內(nèi)質(zhì)網(wǎng)因鈣丟失而形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一種工具試劑)以增加胞漿中鈣水平，結(jié)果TG的加入雖增加了胞漿內(nèi)鈣離子水平但并未發(fā)現(xiàn)因此而能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，相反與鈣離子剝奪培養(yǎng)基中的細(xì)胞一樣蛋白質(zhì)合成仍然受到抑制；Brostrom等在對(duì)鈣通道蛋白載體表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)鈣離子能從胞漿重新復(fù)回到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣濃度維持穩(wěn)定，因此細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成抑制現(xiàn)象得到明顯改善，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)蛋白質(zhì)合成暫停發(fā)生十分迅速，是一數(shù)分鐘內(nèi)即完成的早期事件。同樣，以能造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙但并不影響胞漿鈣水平的其它工具試劑如DTY(二硫蘇糖醇，能干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新生蛋白質(zhì)二硫鍵的形成)和tunicamycin(能阻礙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新生蛋白質(zhì)糖基化修飾)等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所孵育的細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成受到抑制，這些現(xiàn)象歸納提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡可能是導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯暫停的直接原因。
參與真核細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合體eIF2(eukaryotic translation initiation factor 2)蛋白有α、β、γ三種亞基，其中eIF2α51位絲氨酸可被磷酸化修飾。正常情況下，eIF2α蛋白以GTP結(jié)合型征募(recruit)起始蛋氨酰tRNA到小亞基核蛋白體，形成小亞基核蛋白復(fù)合體，后者識(shí)別與結(jié)合模板mRNA，再裝配成具有蛋白質(zhì)合成功能的核蛋白復(fù)合體。隨后GTP被降解，釋放GDP結(jié)合型eIF2蛋白。只有當(dāng)GDP結(jié)合型eIF2蛋白經(jīng)eIF2β作用重新轉(zhuǎn)換成GTP結(jié)合型eIF2蛋白時(shí)才能參與下一輪核蛋白復(fù)合體組裝與啟動(dòng)工作，但是eIF2α蛋白51位絲氨酸發(fā)生磷酸化修飾后eIF2β就不能促進(jìn)其GTP-GDP交換，因此，eIF2不能再被重復(fù)利用，從而抑制蛋白質(zhì)合成的啟動(dòng)過(guò)程?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、酵母細(xì)胞氨基酸饑餓、哺乳類動(dòng)物細(xì)胞血紅素短缺、雙鏈RNA病毒感染均能通過(guò)eIF2α磷酸化途徑使蛋白質(zhì)合成受到抑制，其中促進(jìn)磷酸化修飾的特異性蛋白激酶分別是PERK(PKR-like ER kinase，PERK)、GCN2(general control non-derepressible-2)、HRI(hemereticulocytes inhibitor)和PKR(double strandRNA-dependent protein kinase)。
PERK屬Ⅰ型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，胞漿側(cè)羧基端的蛋白激酶活性既可使eIF2α磷酸化，又可使自身磷酸化，是PERK的主要功能區(qū)；而游離于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的氨基端蛋白主要是感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激信息。TG介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激實(shí)驗(yàn)證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)eIF2α磷酸化與蛋白質(zhì)翻譯停止，蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PERK電泳條帶遷移率較未經(jīng)應(yīng)激處理組降低，降低的PERK電泳條帶經(jīng)堿性磷酸酶處理后遷移率恢復(fù)正常，說(shuō)明PERK發(fā)生了磷酸化修飾；體外實(shí)驗(yàn)證明，該P(yáng)ERK條帶的磷酸化來(lái)自PERK自身的催化活性，而不是其他激酶作用的結(jié)果；只有磷酸化的PERK才能使eIF2α蛋白51位絲氨酸磷酸化，經(jīng)PERK作用使位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外側(cè)eIF2α蛋白磷酸化可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)蛋白質(zhì)合成抑制的重要原因。近來(lái)從人類胰腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有一種與PERK同源的蛋白PEK(pancmatic eIF2αkinase，PEK)也可對(duì)eIF2α磷酸化，對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯啟動(dòng)同樣有抑制作用。
PERK蛋白感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)應(yīng)激的過(guò)程可能與免疫球蛋白結(jié)合蛋白BiP(immunoglobulin binding protein，orglucose regulating protein78，又稱為BiP/GRP78)的游離有關(guān)．內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)大量未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)發(fā)生堆積，原來(lái)大量存在的而且主要與PERK結(jié)合的BiP轉(zhuǎn)而去應(yīng)付未折疊蛋白，從而使PERK暴露、PERK間相互聚合、促進(jìn)磷酸化發(fā)生，PERK自身激活并催化底物eIF2α蛋白發(fā)生磷酸化。Yamamoto研究發(fā)現(xiàn)高爾基體KDEL受體(一種幫助從高爾基體返回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的BiP運(yùn)載蛋白受體)缺失時(shí)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)因BiP大量丟失導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的合成抑制，提示蛋白質(zhì)合成抑制可能與PERK充分暴露而被激活有關(guān)。
綜上認(rèn)為，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)與PERK結(jié)合的BiP由于應(yīng)付大量的未折疊蛋白質(zhì)而使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)PERK蛋白暴露，發(fā)生自身磷酸化與二聚化，活化的PERK蛋白進(jìn)一步使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外側(cè)的eIF2α發(fā)生磷酸化修飾，磷酸化修飾的eIF2α不受eIF2β的GTP-GDP的交換作用，使得蛋白質(zhì)合成啟動(dòng)過(guò)程暫停。
2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中期整合應(yīng)激反應(yīng)的出現(xiàn)
大多數(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)PERK因BiP參與未折疊蛋白的結(jié)合而被游離出來(lái)、PERK間聚合、然后激活下游eIF2α磷酸化，反饋抑制蛋白質(zhì)合成的起始過(guò)程。蛋白質(zhì)合成的暫停減輕了新生蛋白肽鏈對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊需求的負(fù)荷與壓力，但這種抑制過(guò)程畢竟是一種臨時(shí)性防御措施。事實(shí)上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)激暴露后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白如GRP78、GRP94以及GADD34(growtharrest and DNA-damage-inducible gene 34)、CHOP(C/EBP-homologousprotein，or growth arrest and DNA-damage-inducible gene153，GADD153)、ATF4(activatingtranscription factor-4)等表達(dá)增加，這樣可提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞處理未折疊蛋白或抵御其它細(xì)胞應(yīng)激的能力。磷酸化eIF2α蛋白與早期蛋白質(zhì)合成暫停有關(guān)，但研究發(fā)現(xiàn)磷酸化eIF2α蛋白同樣與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中期應(yīng)激蛋白的表達(dá)與蛋白質(zhì)合成啟動(dòng)的恢復(fù)也有關(guān)系，可見(jiàn)磷酸化eIF2α蛋白整合了包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中期蛋白質(zhì)合成中斷的恢復(fù)與應(yīng)激蛋白的表達(dá)等所有后續(xù)反應(yīng)，這類反應(yīng)總稱為整合應(yīng)激反應(yīng)(integrated stress response，ISR)，這種整合反應(yīng)一般需1～2h才能完成。
整合應(yīng)激反應(yīng)中蛋白質(zhì)合成中斷的恢復(fù)與磷酸化eIF2α蛋白脫磷酸作用有關(guān)。GADD34基因是許多細(xì)胞應(yīng)激因素都能調(diào)控表達(dá)的一個(gè)基因，它編碼蛋白磷酸化酶Ⅰ復(fù)合體中的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基，實(shí)驗(yàn)證明GADD34具有使磷酸化eIF2α蛋白脫磷酸，即恢復(fù)蛋白質(zhì)翻譯啟動(dòng)的作用，例如TG較長(zhǎng)時(shí)間處理eIF2α-/-型或PERK-/-型細(xì)胞，然后提取細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，用免疫印跡法檢測(cè)，結(jié)果均未能檢測(cè)到GADD34蛋白．而野生型細(xì)胞經(jīng)TG處理后GADD34表達(dá)，說(shuō)明GADD34蛋白是磷酸化eIF2α蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果。Koiim等在GDD34基因水平將去磷酸化作用堿基序列刪除，建立轉(zhuǎn)基因小鼠GADD34aΔC/ΔC，然后以TG喂養(yǎng)GADD34ΔC/ΔC小鼠．結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)eIF2α蛋白一直保持磷酸化狀態(tài)，蛋白質(zhì)合成一直保持停止?fàn)顟B(tài)，小鼠死亡率增加，而野生型小鼠eIF2α蛋白經(jīng)歷短暫磷酸化后，迅速去掉磷酸根，同時(shí)蛋白質(zhì)合成經(jīng)歷約0．5～2h短暫的抑制后迅即回升。由此可見(jiàn)，GADD34參與了磷酸化eIF2α蛋白的去磷酸化作用，而且能使蛋白質(zhì)的合成中斷得以恢復(fù)。
顯然GADD34基因的表達(dá)是整合應(yīng)激反應(yīng)中蛋白質(zhì)合成中斷后重新恢復(fù)的重要環(huán)節(jié)，除GADD34蛋白表達(dá)外還有不少其它的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中期高表達(dá)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)TG處理野生型細(xì)胞時(shí)BiP/GRP78和GRP94高表達(dá)，但是TG處理GADD34ΔC/ΔC轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)GRP78和GRP94反而低表達(dá)；轉(zhuǎn)基因eIF2α-S52A細(xì)胞(該細(xì)胞eIF2α蛋白51位上不能被磷酸化)較相應(yīng)野生細(xì)胞經(jīng)TG較長(zhǎng)時(shí)間作用后GRP78與GADD34表達(dá)也明顯減少，這些事實(shí)說(shuō)明磷酸化eIF2α蛋白可能直接與應(yīng)激蛋白高表達(dá)有關(guān)。因此，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中期，由磷酸化eIF2α蛋白統(tǒng)一整合了包括調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達(dá)與蛋白質(zhì)合成啟動(dòng)暫停的重新開(kāi)始等在內(nèi)的所有后續(xù)應(yīng)激反應(yīng)。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)BiP/GRP78和GRP94以及ATF4、CHOP、GADD34等表達(dá)增加的機(jī)制是不能用GADD34介導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成中斷恢復(fù)模型加以解釋，因?yàn)楸磉_(dá)增加的GADD34蛋白促進(jìn)了磷酸化eIF2α蛋白的去磷酸化作用，進(jìn)而使蛋白質(zhì)合成中斷恢復(fù)的。研究發(fā)現(xiàn)，ATF4與GADD34等mRNA在細(xì)胞漿中本身大量存在，但是ATF4與GADD34等mRNA序列5’端存在特殊的上游開(kāi)放閱讀框架(upstream open readingframes，uORFs)結(jié)構(gòu)使得ATF4和GADD34通常總是處于翻譯抑制狀態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞漿中磷酸化eIF2α蛋白或IRE1(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)一種參與RNA變位剪接和eIF2蛋白磷酸化的雙功能酶)會(huì)激活A(yù)TF4和GADD34的mRNA上游閱讀框架結(jié)構(gòu)，表達(dá)ATF4和GADD34蛋白。但是激活的這些特殊結(jié)構(gòu)mRNA如何在蛋白質(zhì)合成普遍性抑制下進(jìn)行翻譯的分子機(jī)理目前還不十分清楚，推測(cè)細(xì)胞內(nèi)可能預(yù)先存有微量GADD34作為“種子”，通過(guò)“種子”引導(dǎo)的eIF2α蛋白去磷酸化作用和mRNA分子中具有uORF結(jié)構(gòu)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白優(yōu)先表達(dá)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激蛋白得到表達(dá)。
3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后期引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)性細(xì)胞凋亡的發(fā)生
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞隨著整合應(yīng)激反應(yīng)的進(jìn)一步演進(jìn)，細(xì)胞一方面積極調(diào)動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白以抵御應(yīng)激誘因所造成的有害影響，同時(shí)調(diào)整內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能以適應(yīng)新的內(nèi)環(huán)境變化要求，另一方面也會(huì)表達(dá)一些有可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡的應(yīng)激蛋白調(diào)節(jié)基因如CHOP等，根據(jù)情況決定后面清除那些根本無(wú)法恢復(fù)到正常功能狀態(tài)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞死亡，通過(guò)細(xì)胞凋亡作用來(lái)摧毀這些受損的細(xì)胞可能是解決內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激受損細(xì)胞不得已的措施。
線粒體細(xì)胞凋亡過(guò)程先是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白如P53、Bax、Par-4的表達(dá)活化，這些凋亡蛋白促進(jìn)線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素c，后者再活化蛋白水解酶caspase-3等，引起細(xì)胞凋亡解體。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡不同于線粒體細(xì)胞凋亡，有一套自身的信號(hào)傳遞通路，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡(ER-associated death，ERAD)途徑。READ途徑包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)CHOP/GADD153表達(dá)、JNK(c-Jun NH2-terminal kinases，JNK)的活化和/或caspase-12蛋白水解酶的活化。
CHOP/GADD153蛋白與JNK是聯(lián)系內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的重要中間信號(hào)分子，caspase蛋白水解酶是執(zhí)行細(xì)胞凋亡作用的終末分子。CHOP基因啟動(dòng)子上具有氨基酸應(yīng)答元件(amino acid responseelement，AARE)，氨基酸剝奪或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等許多因素分別通過(guò)AARE或其他相關(guān)元件來(lái)調(diào)節(jié)CHOP蛋白表達(dá)，CHOP蛋白或與C/EBP或與Jun/Fos家族蛋白成員形成雜二聚體，調(diào)節(jié)下游凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明TG長(zhǎng)時(shí)間作用細(xì)胞時(shí)CHOP大量表達(dá)且進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和細(xì)胞死亡，在刪除CHOP蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中加入TG后長(zhǎng)時(shí)間作用發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡反而明顯減弱，表明CHOP介導(dǎo)了TG內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。JNK能對(duì)底物c-JUN或AFT2等轉(zhuǎn)錄因子氨基末端進(jìn)行磷酸化修飾、激活這些轉(zhuǎn)錄因子以調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明同型半胱氨酸(HCY)劑量依賴性引起內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡，其中IRE1-JNK-ATF3途徑參與了細(xì)胞凋亡的激活過(guò)程。Caspase蛋白水解酶(半胱氨酸天冬氨酸酶簡(jiǎn)稱)屬白介素1β轉(zhuǎn)換酶(interleukin-1beta converting enzyme，ICE)家族，是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的水解酶。目前發(fā)現(xiàn)該家族共14個(gè)成員，各自作用不同，但彼此間形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，其中caspase-9居這個(gè)凋亡信號(hào)系統(tǒng)中的樞紐位置，caspase-3負(fù)責(zé)拆卸細(xì)胞等，capase-12僅產(chǎn)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并僅在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)活化蛋白水解酶．TG處理細(xì)胞時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)caspase-12酶活性升高，然后caspase-12從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿，在胞漿激活caspase-9和caspase-3等，之后引發(fā)細(xì)胞凋亡。通常伴侶蛋白BiP與caspase-7和caspase-12形成復(fù)合體，細(xì)胞不會(huì)表現(xiàn)凋亡，但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)BiP減少可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明caspase-12暴露活化也可引起細(xì)胞凋亡。
目前內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)研究仍在不斷發(fā)展，原認(rèn)為凋亡分子Bax和Bak僅存在于線粒體外膜，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)同樣存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上；TG可分別刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體上Bax和Bak蛋白引起構(gòu)象變化與二聚化，無(wú)論是經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體引起的Bax和Bak蛋白活化均可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是引起細(xì)胞凋亡的途徑不完全相同，如經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Bax分子僅引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的caspase-12和鈣離子所參與的細(xì)胞凋亡過(guò)程；經(jīng)線粒體Bax介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要由caspase-7和PARP分子參加的凋亡過(guò)程，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性細(xì)胞凋亡可能是與線粒體性細(xì)胞凋亡不同的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
4臨床疾病的研究與展望
家族性帕金森氏病患者神經(jīng)細(xì)胞中存在帕金蛋白(parkin)的突變體形式。parkin蛋白本身具有泛素連接酶E3(E3 ubiquitin ligase)功能，能促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞中神經(jīng)毒性蛋白如長(zhǎng)鏈多聚谷氨酰胺蛋白(anexpanded polyglutamine protein)的降解，但是帕金森氏病患者Parkin突變體沒(méi)有泛素連接酶E3的作用，因此不能及時(shí)清除神經(jīng)細(xì)胞中神經(jīng)毒性蛋白，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)神經(jīng)毒性蛋白堆積發(fā)生應(yīng)激，長(zhǎng)期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，這可能是帕金森氏病發(fā)生的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。
我們?cè)谛∈蟾骨蛔⑸銱CY復(fù)制的高同型半胱氨酸血癥模型上測(cè)定了小鼠組織金屬硫蛋白(metallothionein，MT)含量的變化．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCY能通過(guò)氧化應(yīng)激作用誘導(dǎo)MT生成，金屬硫蛋白與伴侶蛋白GRP78同樣是抗氧化應(yīng)激的重要細(xì)胞保護(hù)分子。高同型半胱氨酸是強(qiáng)烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激原，早期能刺激細(xì)胞外基質(zhì)中超氧化物歧化酶表達(dá)，晚期刺激GRP78表達(dá)，我們推測(cè)高同型半胱氨酸刺激金屬硫蛋白表達(dá)可能是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)的一部分，血管平滑肌細(xì)胞受到氧化應(yīng)激也會(huì)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。
Shibata在小鼠中腦動(dòng)脈血管暫時(shí)性梗塞模型中發(fā)現(xiàn)，1 h梗塞后缺血再灌注時(shí)Bip/GRP78表達(dá)增加，5 h梗塞后缺血再灌注則caspase-12表達(dá)增加，免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡TUNEL陽(yáng)性與caspase-12陽(yáng)性共存，證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后由caspase-12引起了神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Hayashi在下丘腦缺血灌注預(yù)處理(preconditioning)后第2天大鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)伴侶蛋白GRP78表達(dá)增加，PERK磷酸化延遲，神經(jīng)細(xì)胞死亡降低，提示缺血灌注預(yù)處理的細(xì)胞保護(hù)可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。
新研究還表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是線粒體應(yīng)激發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)，因此有必要重新評(píng)價(jià)心腦血管病、老年癡呆、糖尿病等多種疾病發(fā)生的線粒體應(yīng)激機(jī)理。同樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為重要而基本的細(xì)胞保護(hù)手段，因此針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激環(huán)節(jié)對(duì)這些疾病治療方案的全新設(shè)計(jì)將會(huì)有進(jìn)一步的發(fā)展。