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張發(fā)仁，許麗艷，沈忠英，李恩民
(1汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤病理學(xué)教研室；
2汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東汕頭515041)
汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報2005年第4期
[摘要]
自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，是生物在其發(fā)育、老化過程中都存在的一個凈化自身多余或受損細(xì)胞器的共同機制。生命體籍此維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)定，這一過程在細(xì)胞清除廢物、結(jié)構(gòu)重建、生長發(fā)育中起重要作用。本文主要對自噬體的形態(tài)和發(fā)生過程、分子機制、生化檢測、與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及其生理、病理功能等方面進行概述，以期較為全面地了解細(xì)胞自噬作用和新研究動態(tài)的相關(guān)資料。
自噬是細(xì)胞通過單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬體，然后運送到溶酶體形成自噬溶酶體并進行多種酶的消化及降解，以實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。而細(xì)胞對這種合成與降解的精細(xì)調(diào)節(jié)，對維持細(xì)胞的自身穩(wěn)態(tài)有重要意義。降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的途徑主要有：
①蛋白酶體，主要消化短壽命蛋白質(zhì)；
②通過形成自噬體，將待降解物(如大多數(shù)長壽命蛋白質(zhì)和細(xì)胞器)運輸?shù)饺苊阁w內(nèi)消化。
自噬是溶酶體降解途徑的主要步驟，通過對自噬體的檢測，可了解自噬體形態(tài)和發(fā)生過程、分子機制、與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及其在某些疾病發(fā)生中的作用。
1自噬與自噬體的形態(tài)及發(fā)生過程
自噬是胞漿大分子物質(zhì)和細(xì)胞器在膜包囊泡中大量降解的生物學(xué)過程。在此過程中，自噬體的形成是關(guān)鍵。在透射電子顯微鏡下自噬體的直徑一般為300～900nm，平均500nm，其雙層膜包囊泡內(nèi)常見的包含物有胞漿成分和某些細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)吞體、過氧化物酶體等。根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運到溶酶體內(nèi)的途徑不同，自噬分為：
①大自噬：多數(shù)人認(rèn)為是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的單層膜凹陷形成杯狀雙層膜樣的分隔膜，進而完全包繞待降解物形成自噬體，接著與溶酶體融合，自噬體內(nèi)細(xì)胞物質(zhì)如細(xì)胞器被溶酶體酶溶解。
②小自噬：是溶酶體的膜直接包裹如長壽命蛋白并在溶酶體內(nèi)降解。
③分子伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)：胞漿內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運到溶酶體腔中被溶酶體酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白分子，所以CMA降解途徑在清除蛋白質(zhì)時有選擇性，而前兩者無明顯的選擇性。
自噬的發(fā)生過程以大自噬為例可人為的將它分為4個階段(圖1)：
①分隔膜的形成。在饑餓、某些激素等因素刺激下，有雙層膜的杯狀分隔膜開始在被降解物的周圍形成。
②自噬體的形成。隨著分隔膜逐漸延伸，將要被降解的胞漿成分完全包繞隔離開形成自噬體。
③自噬體的運輸、融合。自噬體形成后將其包裹物運輸至溶酶體內(nèi)與溶酶體融合形成自噬溶酶體，這一過程并非簡單的擴散，而是通過細(xì)胞骨架微管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的傳輸實現(xiàn)的。
④自噬體的裂解。自噬體融合后被溶酶體中的水解酶溶解，它先經(jīng)過囊泡酸化，達(dá)到所需pH值后經(jīng)多種蛋白酶作用使囊內(nèi)容物降解，降解產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)利用。
2真核細(xì)胞中自噬的分子調(diào)控
2．1自噬體形成的分子機制
根據(jù)酵母自噬體的發(fā)生過程可分為：
①自噬的誘導(dǎo)：雷帕霉素作用的靶位點(Target ofrapamycin，TOR)是氨基酸、ATP和激素的感受器，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和自噬的發(fā)生過程有重要作用。與bcl-2作用的蛋白beclin-1可以促進缺乏自噬作用的酵母細(xì)胞中的自噬作用。此外，GDP結(jié)合的C蛋白亞基Gai3是自噬的活化因子，高濃度cAMP也會誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。
②自噬體的形成：在酵母中發(fā)現(xiàn)自噬體的形成依賴于兩個泛素樣結(jié)合系統(tǒng)——Apg12-Apg5和Apg8系統(tǒng)。這種蛋白系統(tǒng)的高度保守性已被實驗證明，在人類發(fā)現(xiàn)的自噬基因有Beclin1、hApg5、hApg12。
③自噬體的運輸、融合：Rho家族涉及細(xì)胞骨架，與自噬體的運輸有關(guān)。自噬體的融合機制與SNARE蛋白Vam3、Vam7、Vti1、Sec19等密切相關(guān)。
④自噬體的裂解：在此起重要作用的有Atg15和Atg22。Atg15通過多囊泡小體途徑向小囊泡轉(zhuǎn)運，這種蛋白起著脂肪酶相似的作用。Atg22是一種囊泡內(nèi)膜蛋白，和Atg15相比，其只對自噬體降解起作用。
2．2自噬的信號調(diào)控
mTOR途徑：酵母中Ser/Thr蛋白激酶Apg1與其它Apg分子結(jié)合共定位于自噬前體膜上。饑餓刺激下，Apg13去磷酸化，并與Apg1結(jié)合，導(dǎo)致Apg17依賴性自噬的發(fā)生。TOR激酶抑制劑雷帕霉素有助于Apg13去磷酸化和Apg1活化，促進自噬發(fā)生。磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅢPI3K)：ClassⅠPI3K磷酸化產(chǎn)物通過PKB/Akt調(diào)控自噬。也有某些激素在自噬調(diào)控中起重要作用，如胰島素可抑制自噬，而胰高血糖素促進之。此外，酪氨酸激酶受體、PKA、酪蛋白激酶Ⅱ、MAP激酶、鈣也存在于自噬錯綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，但機制不甚清楚。
3自噬體的檢測
自噬體的檢測對研究自噬尤為重要：
①以透射電子顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)檢測(俗稱檢測自噬體的金指標(biāo))。在透射電鏡下可見損傷的細(xì)胞器如線粒體的腫脹變性，其周圍出現(xiàn)空泡狀雙層膜樣結(jié)構(gòu)、繼而雙層膜環(huán)繞成自噬體、進而與溶酶體融合，消化，也可見自噬溶酶體內(nèi)不能降解的殘體等。
②自噬體膜標(biāo)志性蛋白質(zhì)的檢測。自噬體膜上標(biāo)志性蛋白質(zhì)有Apg12-Apg5結(jié)合體和微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3(LC3)。Apg12和Apg5在翻譯后就像單個分子一樣共價結(jié)合在一起，它定位在自噬體雙層隔離膜的整個延長階段。LC3是酵母菌自噬基因(Apg7/Apg8)在哺乳動物中的同源物，和前者相比，LC3除了定位在自噬體分隔膜上，也一直以和磷脂酰乙醇胺即腦磷脂(PE)結(jié)合的形式(LC3-PE)存在于自噬體形成各階段的內(nèi)外膜上，在自噬溶酶體膜上也可見。通過與綠色熒光蛋白(GYP)結(jié)合成Apg12-Apg5-GFP、IE3-GFP，即可實現(xiàn)對自噬體的檢測。
③單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。是自噬發(fā)生過程中分析分子水平機制的一種特異的檢測自噬體方法。自噬體形成依賴的第二個泛素樣結(jié)合系統(tǒng)(Apg8)是位于自噬囊泡膜上與MDC特異結(jié)合的生化標(biāo)志，通過熒光染色，在熒光顯微鏡下可見核周區(qū)域陽性顯色。
④間接自噬體檢測法。自噬溶酶體及其不能降解的產(chǎn)物——殘體的檢測。自噬體和溶酶體融合后，除上述的LC3-GFP法檢測外，還有吖啶橙染色法。它是一種熒光染料作為非極性反膠態(tài)分子團的分子探針，在自噬溶酶體內(nèi)酸性磷酸酶活性增強下顯著著色。對殘體的檢測主要是對脂褐素顆粒的顯微觀察。
4自噬與凋亡、壞死
細(xì)胞的死亡方式包括程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞壞死。其中程序性細(xì)胞死亡可分為細(xì)胞凋亡和自噬型細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡的典型細(xì)胞核改變：染色質(zhì)凝集邊聚、出現(xiàn)透明區(qū)，后來形成半月形核、花瓣狀核、空泡狀核等。此外，胞漿中還可見許多自噬體、自噬溶酶體和凋亡小體。細(xì)胞凋亡依賴于細(xì)胞色素C和胱門蛋白酶的作用。自噬型細(xì)胞死亡始于細(xì)胞的自噬作用，以胞漿中形成大量自噬囊泡為特征，其內(nèi)存在多種細(xì)胞成分(生物大分子和細(xì)胞器等)，高爾基體、多聚核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的降解都早于核解體。在此過程中，線粒體功能完整，為自噬提供所需能量，當(dāng)線粒體絕大部分變性、溶解，染色質(zhì)斷裂、核解體時稱之為自噬型細(xì)胞死亡。細(xì)胞壞死，是由外部的化學(xué)、物理或生物因素的侵襲而造成的細(xì)胞崩潰裂解，是非溶酶體囊泡進行降解作用的細(xì)胞死亡，蘇木素-伊紅染色后光鏡下呈片狀無組織結(jié)構(gòu)紅染區(qū)。
目前，人們更為關(guān)注的是對細(xì)胞凋亡的研究過程中存在著的細(xì)胞自噬以及自噬型細(xì)胞死亡。它們之間也存在一些聯(lián)系，在乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡中可見到具有凋亡和核固縮形態(tài)改變的細(xì)胞死亡，都呈現(xiàn)廣泛的自噬體形成。從分子水平研究自噬與凋亡關(guān)系的新發(fā)現(xiàn)是ASP基因的克隆，它的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在正常和凋亡細(xì)胞中都有相當(dāng)水平的表達(dá)，編碼具有276個氨基酸的蛋白，其基因與自噬基因APG5同源，提示自噬與凋亡之間存在一定的關(guān)系。
5自噬的生理、病理功能
5．1自噬的生理功能
5．1．1自噬在細(xì)胞代謝中的作用
自噬能清除不正常構(gòu)型的蛋白質(zhì)，并消化受損和多余的細(xì)胞器，是真核細(xì)胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)。在細(xì)胞新陳代謝、結(jié)構(gòu)重建、生長發(fā)育中起著重要作用。在饑餓和新生兒早期，自噬作用明顯加強，自噬體顯著增多。
5．1．2自噬在老化、壽命延長中的作用
隨著年齡的增長，氧化自由基對蛋白質(zhì)等的損壞以及細(xì)胞自噬能力的降低，造成異常蛋白質(zhì)、DNA以及細(xì)胞器進行性地積聚，成為體內(nèi)的生物垃圾。那些積聚的蛋白質(zhì)分子是老化與許多急、慢性疾病的主要病因，如老化細(xì)胞中的脂褐質(zhì)、阿爾茨海默病等。胰島素樣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是線蟲dauer發(fā)育階段和壽命的負(fù)調(diào)控因子，酪氨酸激酶是該途徑中的一個關(guān)鍵蛋白質(zhì)，與此相關(guān)的基因是Cebec-1，而它是ATG6(APG6)/VPS30/Beclin 1的同源基因，這提示自噬與壽命延長相關(guān)。
5．2自噬的病理功能
5．2．1自噬與病原微生物侵染
吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞可殺死在細(xì)胞外的病原菌，當(dāng)病原菌以內(nèi)吞形式進入細(xì)胞后自噬是細(xì)胞主要的防御形式。如A族鏈球菌內(nèi)吞小泡進入細(xì)胞質(zhì)后，自噬小泡馬上將其包裹，并運送到溶酶體降解。而在自噬缺陷型細(xì)胞中，A族鏈球菌就會存活、繁殖，并從細(xì)胞釋放出來再感染其他細(xì)胞。
5．2．2自噬與神經(jīng)退行性疾病
自噬參與異常蛋白質(zhì)的降解，有利于防止神經(jīng)元內(nèi)異常蛋白質(zhì)的蓄積，如帕金森病中的Synuclein蛋白的蓄積與自噬能力下降有關(guān)。因而自噬作用過度活躍會造成線粒體功能障礙，如享延頓氏舞蹈病與享延頓蛋白(Htt)的蓄積，Htt激發(fā)自噬伴隨著細(xì)胞凋亡蛋白酶的激活和大量線粒體的受損。
5．2．3自噬與Danon肌病
Danon肌病患者的病理標(biāo)志是在骨骼肌和心肌細(xì)胞胞質(zhì)中包含有糖原的自噬小泡。實驗發(fā)現(xiàn)小鼠L4MP-2缺失后自噬小泡不能和溶酶體融合，而產(chǎn)生類似Danon肌病的標(biāo)志性小泡，由此認(rèn)為原發(fā)Lamp-2缺陷是造成Danon肌病的病因。
5．2．4自噬與腫瘤
人們發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞中自噬能力明顯低于正常細(xì)胞，因而對血清/氨基酸降低或高細(xì)胞密度等因素反應(yīng)遲鈍。例如，在轉(zhuǎn)化的纖維細(xì)胞中，其蛋白降解速率低于正常細(xì)胞，特別是在饑餓條件下更為明顯。很顯然腫瘤細(xì)胞通過改變自噬作用的能力而獲得了比正常細(xì)胞更強的生存能力，但其內(nèi)在機制尚不清楚。不過可以肯定的是Beclin 1的過度表達(dá)可以抑制乳腺癌的生長正是通過增強自噬來實現(xiàn)的。
6結(jié)語
自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，貫穿于正常細(xì)胞生長發(fā)育和生理病理過程，對防止如神經(jīng)退行性病變、腫瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病以及對防止老化、延長壽命有積極作用。因此對細(xì)胞自噬作用和自噬型細(xì)胞死亡的研究不僅具有理論意義，而且也具有非常重要的應(yīng)用價值。自噬基因的發(fā)現(xiàn)使我們從分子水平認(rèn)識了自噬，但對自噬起源、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其對細(xì)胞生存影響的了解尚不全面。隨著對自噬作用機制的深入研究，我們期望可以通過調(diào)控細(xì)胞的自噬水平，控制癌癥及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，延緩衰老，提高生存質(zhì)量。