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作者：褚啟龍楊克敵王愛國
華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，武漢，430030
摘要：
大量研究表明，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前對這一現(xiàn)象有四種解釋：ROS活化核轉(zhuǎn)錄因子KB并誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子-κB表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；ROS導(dǎo)致DNA損傷，激活P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及ROS激活SAPK通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但從總體上看，其分子機(jī)制還不十分清楚，有待進(jìn)一步研究。
機(jī)體在有氧代謝過程中產(chǎn)生的活性氧族(reactive oxygenspecies，ROS)主要包括O2-、OH、H2O2、HOCl、NO、O3和單線態(tài)氧等，對大多數(shù)細(xì)胞都具有毒性作用。在正常情況下，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和ROS清除系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。由于種種原因，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增多或/和機(jī)體清除ROS能力的下降，機(jī)體就會出現(xiàn)氧化應(yīng)激(oxidative stress)。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，體內(nèi)組織細(xì)胞ROS量相對升高，超過機(jī)體的清除能力，可導(dǎo)致機(jī)體組織脂質(zhì)過氧化水平升高，引起DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)的表達(dá)異常，對機(jī)體造成損害。氧化應(yīng)激使機(jī)體處于易損狀態(tài)，同時能增強(qiáng)致病因素的毒性作用，可導(dǎo)致基因突變，它不僅與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡存在著十分密切的關(guān)系。
細(xì)胞凋亡(apoptosis)是維持正常組織形態(tài)和一定功能的主動自殺過程，是在基因控制下按照一定程序進(jìn)行的細(xì)胞死亡，故又稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)。凋亡細(xì)胞具有典型的形態(tài)學(xué)改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜出現(xiàn)囊泡、細(xì)胞皺縮、核固縮、DNA有序片段化等。細(xì)胞凋亡是機(jī)體的一種生理機(jī)制，在維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要的作用，但細(xì)胞凋亡過高或過低都會對機(jī)體產(chǎn)生不利的影響。
1氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的關(guān)系
氧分子作為氧化磷酸化的終末電子受體，在需氧代謝中占有重要地位，但這種對電子需求的同時也導(dǎo)致了各種活性氧的形成，如O2-、OH及具有氫抽提能力的H2O2、HOCl等。ROS可啟動一個鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，易與細(xì)胞膜上的各種不飽和脂肪酸及膽固醇反應(yīng)，這種直接作用于細(xì)胞的氧化損傷能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但生物體在進(jìn)化的過程中具備有效的抗ROS防御體系，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)及抗氧化物質(zhì)(如維生素C、維生素E)等，因此，機(jī)體代謝耗氧的同時常伴有ROS的形成，細(xì)胞的功能狀態(tài)取決于ROS與抗氧化能力的平衡。
1．1外源性活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
1991年，Lennon等發(fā)現(xiàn)低濃度的H2O2(10～100μmol/L)可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，當(dāng)H2O2濃度繼續(xù)增高時，便可導(dǎo)致大量的細(xì)胞壞死。隨后有學(xué)者用5μmol/L H2O2作用于胸腺細(xì)胞，8h后發(fā)現(xiàn)35％的細(xì)胞發(fā)生凋亡，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到100μmol/L時，凋亡細(xì)胞達(dá)42％。高穎等用300μmol/L H2O2作用于人慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞(K652細(xì)胞)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核固縮、核破裂，F(xiàn)CM-DNA檢測在G0/G1峰前存在一低DNA含量“凋亡峰”，DNA電泳顯示間隔180～200bp的梯形圖譜。近期，Ishisaka等在用H2O2(10～50μmol/L)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的過程中觀察到DNA斷裂，并發(fā)現(xiàn)線粒體釋放CytC和caspase-3被激活；當(dāng)H2O2濃度達(dá)50μmol/L時，溶酶體明顯不穩(wěn)定。Ishisaka根據(jù)大量的研究報道及自己的研究成果提出，H2O2是一種細(xì)胞凋亡介質(zhì)。此外，氧化的低密度脂蛋白(OxLDL)能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡，脂質(zhì)過氧化物15-過氧化二十碳四烯酸(15-HPETE)和13-過氧化十二碳二烯酸(13-HPODE)亦可誘導(dǎo)A301細(xì)胞發(fā)生凋亡。
正常細(xì)胞內(nèi)每天能產(chǎn)生約1×1011個ROS分子，這些ROS主要來源于：
(1)細(xì)胞進(jìn)行有氧代謝時呼吸鏈產(chǎn)生的副產(chǎn)物，如O2-、H2O2和OH；
(2)呼吸爆發(fā)的產(chǎn)物，如O2-、NO、H2O2和Cl-；
(3)脂肪及其他大分子降解時的副產(chǎn)物，如H2O2；
(4)細(xì)胞色素P450系統(tǒng)在發(fā)揮解毒作用時產(chǎn)生的ROS。
研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加或/和抗ROS能力下降時，均可導(dǎo)致內(nèi)源性ROS增多。有學(xué)者報道，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激TNF受體，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平迅速升高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且這種細(xì)胞凋亡能被硫氧還原蛋白或N-乙酰半胱氨酸(NAC)所抑制，同時細(xì)胞對TNF-α的敏感性與SOD水平的降低明顯相關(guān)。王愛國等讓大鼠自由攝取含150mg/L NaF的水10周后發(fā)現(xiàn)，大鼠體內(nèi)GSH含量下降、ROS和LPO水平升高，肝細(xì)胞凋亡率顯著增高，肝細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激之間存在明顯的正相關(guān)。Murakawa等從鯖魚體內(nèi)提取并純化一種凋亡誘導(dǎo)蛋白(apoptosis-inducing protein，AIP)，用AIP作用于哺乳類細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)H2O2水平顯著升高，并誘導(dǎo)細(xì)胞快速凋亡。MG132(一種26S蛋白小體抑制劑)使HepG2細(xì)胞H2O2水平顯著性升高和線粒體膜電位下降，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這種HepG2細(xì)胞凋亡能被抗氧化劑如NAC、GSH和CAT所阻斷；白細(xì)胞介素-1(IL-1)可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞iNOS表達(dá)，使NO含量升高而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Woo等研究發(fā)現(xiàn)，As2O3可致人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡早期ROS(主要是H2O2)濃度升高和線粒體膜電位下降，隨后出現(xiàn)caspase-3的激活和DNA斷裂，同時發(fā)現(xiàn)NAC能完全抑制As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，該細(xì)胞與CAT共同孵育也顯著性抑制As2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。上述資料充分表明：內(nèi)源性活性氧生成增多可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
1．3抗氧化應(yīng)激作用可阻止細(xì)胞凋亡
氧化應(yīng)激使植物表現(xiàn)出與人一樣的細(xì)胞凋亡，而植物體內(nèi)的各類抗氧化物質(zhì)(如醌類、維生素C、維生素E、酶及多肽類等)能保護(hù)植物免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡。許多學(xué)者也證實抗氧化劑(如NAC、GSH和CAT等)具有抗凋亡作用。不少學(xué)者認(rèn)為抗氧化物質(zhì)是通過清除ROS的方式起到抗凋亡的作用，但Anuradha等研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化物NAC和GSH能阻止NaF誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡，并認(rèn)為NAC和GSH抗凋亡作用是通過維護(hù)線粒體跨膜壓、阻止線粒體釋放CytC和Bcl-2下調(diào)實現(xiàn)的。
Bcl-2是原癌基因bcl-2的表達(dá)產(chǎn)物，是先被發(fā)現(xiàn)的哺乳類細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子，它與死亡基因ced-9編碼的Ced-9分子同源，而Ced-9與線粒體呼吸鏈細(xì)胞色素b560復(fù)合物Ⅱ相似，說明Ced-9可能具有氧化還原或調(diào)節(jié)ROS的功能，同時也提示Bcl-2具有調(diào)節(jié)ROS的作用。細(xì)胞內(nèi)bcl-2表達(dá)增強(qiáng)可阻斷ROS相關(guān)的細(xì)胞凋亡，而且Bcl-2能抑制ROS導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，但Bcl-2是以什么方式阻斷ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡目前尚無定論。有報道，在GSH耗竭的神經(jīng)細(xì)胞，Bcl-2不僅可中和H2O2和阻止脂質(zhì)過氧化物的形成，而且可抑制細(xì)胞壞死，據(jù)此有人認(rèn)為Bcl-2通過抑制ROS的形成而阻止細(xì)胞凋亡；但另有研究顯示，Bcl-2能抑制缺乏ROS的細(xì)胞凋亡，綜合多方面資料來看，抑制ROS的形成并非Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的途徑。Steinman認(rèn)為，Bcl-2本身不是一種抗氧化劑，而是作為一種氧化原對細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力的增強(qiáng)，如SOD、GSH-Px、CAT等酶活性升高，從而阻止細(xì)胞凋亡；不過也有人認(rèn)為，Bcl-2主要是通過維護(hù)線粒體膜的跨膜壓，阻抑線粒體釋放死亡因子如CytC、凋亡誘導(dǎo)因子(a!ooptosis-inducingfactor，AIF)、Pro-caspase-3，6，7等而起到抗凋亡作用的。
2氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制
氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制目前還不十分清楚，概括起來主要有以下四種認(rèn)識。
2．1 ROS活化NF-κB并誘導(dǎo)NF-κB表達(dá)
核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(nuclear factor-KappaB，NF-κB)在正常細(xì)胞中與其抑制蛋白(IKB)結(jié)合而處于失活狀態(tài)，許多刺激因素如干擾素(IFN)、脂多糖(LPS)、IL-1、紫外線、病毒等都可誘導(dǎo)IKB磷酸化而使NF-κB活化。NF-κB的激活通常是由氧化刺激引起的，因為ROS可促進(jìn)蛋白激酶C(PKC)的激活，活化的PKC磷酸化IKB，導(dǎo)致后者與NF-κB解離而使之活化。kotharius等研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可活化對其敏感的核因子NF-κB；Angkeow等認(rèn)為，細(xì)胞外的氧化刺激可激活細(xì)胞膜上Raci調(diào)控的NAD(P)H氧化酶[racl-regulated NAD(P)H oxidase]，后者促使細(xì)胞漿中ROS的水平增高，ROS可直接激活NF-κB，也可以通過氧化還原因子-1(redox factor-1，Ref-1)或其他途徑間接使NF-κB活化，如通過調(diào)節(jié)IKB激酶的活性及影響NF-κB與IKB的親和力的方式來調(diào)節(jié)NF-κB的活性。Augkeow等在研究中發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，Ref-1在細(xì)胞漿中抑制Racl誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和NF-κB的激活，但是它一旦進(jìn)入細(xì)胞核后，可以提高NF-κB與DNA的結(jié)合能力，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出核內(nèi)外的雙向作用。NF-κB被激活后，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與凋亡相關(guān)基因如c-myc等的NF-κB調(diào)控元件結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。高穎等用300μmol/LH2O2作用于K652細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡，LCSM(激光共聚焦掃描顯微鏡)顯示凋亡細(xì)胞內(nèi)NF-κB表達(dá)增多，提示NF-κB具有促凋亡作用。
2．2線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
線粒體是重要的細(xì)胞器，其DNA(mtDNA)是裸露的，并與呼吸鏈和富含脂質(zhì)的線粒體膜緊密相連，使其對氧化應(yīng)激損害的敏感性較核DNA更高；加之催化mtDNA復(fù)制的DNA聚合酶不具備校讀功能及mtDNA缺乏修復(fù)機(jī)制等原因，造成mtDNA的損傷積累效應(yīng)，從而出現(xiàn)片段的丟失、修飾及插入突變，突變的mtDNA可編碼結(jié)構(gòu)和/或功能改變的蛋白質(zhì)(其中一些參與電子傳遞)，又進(jìn)一步促進(jìn)氧自由基的生成，造成惡性循環(huán)。Zmmami等的實驗結(jié)果表明ROS的增加可直接或間接損傷線粒體膜，造成膜電位下降，一些學(xué)者的研究結(jié)果支持這一結(jié)論。而線粒體膜電位的下降可導(dǎo)致膜的通透性增高，使線粒體膜間腔的CytC釋放入胞漿，與凋亡激活因子-1(apopotosisactivating factorl，Apaf-1)及pro-caspase-9形成凋亡小體(apoptosome)，在ATP參與下，凋亡小體內(nèi)的pro-caspase-9可自身激活，形成具有活性的caspase-9，后者進(jìn)一步激活caspase-3、6、7等；活化的caspase可進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體膜破裂，致使線粒體進(jìn)一步釋放其他一些caspases及激活因子(如AIF、熱休克蛋白60/100(Hsp60/100)等)；caspase-3、6、7被激活后，可催化靶底物分裂，如分裂DNA片段化因子45(DNA Fragmentation factor 45，DFF45)釋放出具有活性的DFF40，后者進(jìn)入核內(nèi)使DNA有序片段化；分裂聚ADP核糖聚合[poly-(ADP-Ribose)polymerase，PARP]和復(fù)制因子C大亞基(largesubmfit of replication factor C，RFC140)引起DNA修復(fù)和復(fù)制障礙，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
2．3 ROS損傷DNA，激活P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
不少學(xué)者認(rèn)為ROS可直接損傷DNA，因為ROS的中間產(chǎn)物自由基可直接作用于核酸，引起堿基的修飾和DNA鏈斷裂，導(dǎo)致聚ADP核酸轉(zhuǎn)移酶的活化和P53的積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，Schmitt等的研究結(jié)果支持這一結(jié)論。DNA斷裂損傷可以激活DNA依賴性的蛋白激酶(DNA-PK)和ATM(ataxia telangiectasia mutated，突變后患運(yùn)動失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥的基因表達(dá)的蛋白分子，是一種絲、蘇氨酸蛋白激酶)，二種酶皆催化c-Abl(一種酪氨酸蛋白激酶)S-465磷酸化激活，后者再結(jié)合P53加強(qiáng)其穩(wěn)定性，這與Martin等的研究結(jié)果吻合，許多凋亡因子基因啟動子都存在P53反應(yīng)元件(P53 responsive element，PRE)，結(jié)合P53后被激活轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如促使Fas、FasL、Apaf-1、DR-5和Bax等表達(dá)增高，而對bcl-2基因則抑制其表達(dá)；同時，P53還促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放TNF-α和Fas，也能與DNA復(fù)制蛋白A(replicationprotein A，RPA)結(jié)合，阻止DNA復(fù)制，上述效應(yīng)激活caspase-3，6，7，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但P53也促進(jìn)P21表達(dá)而導(dǎo)致G1期阻滯，為什么DNA受損的細(xì)胞向凋亡方向而不是向細(xì)胞周期阻滯方向發(fā)展呢?Seoane等的研究提供了一個合理的解釋，轉(zhuǎn)錄因子Myc被DNA連接蛋白Miz-1招募到P21啟動子上，阻止P53及其他活化因子對P21的激活，從而選擇性地抑制了P53對P21的轉(zhuǎn)錄活化作用，抑制P21表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。也有人認(rèn)為ROS激活P53，誘導(dǎo)FDXP基因(P53家族一個靶基因)表達(dá)FR(ferredoxinreductase)，使細(xì)胞對ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更敏感。
2．4 ROS激活SAPK通路，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡
絲裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)信號通路包括三個主要的蛋白磷酸化級聯(lián)，即細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶(ERKs)、C-Jun N-末端激酶(JNKs)和P38-MAPKs，后兩者可被多種應(yīng)激原激活，故也稱應(yīng)激活化的蛋白激酶(SAPKs)。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，ROS可激活P38通路；不少學(xué)者也證實了ROS可激活JNK。在靜止細(xì)胞中，JNK與P38定位于細(xì)胞漿與細(xì)胞核，一旦被激活，細(xì)胞漿中JNK與P38轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，磷酸化修飾轉(zhuǎn)錄因子ATF-2和EIK-1，促進(jìn)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，同時JNK與P38還磷酸化激活MAPK激活蛋白激酶2與3(MAPKAPK2，3），進(jìn)而對低分子量的熱休克蛋白磷酸化，Hsp能易化激活caspase，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Inoshita等研究顯示，氧化應(yīng)激導(dǎo)致JNK活化，后者磷酸化Mcl-1(Bcl-2家族成員之一)絲氨酸121和酪氨酸，使Mcl-1失活，導(dǎo)致細(xì)胞抗凋亡能力下降，而轉(zhuǎn)染未磷酸化的Mcl-1后，細(xì)胞抗凋亡能力得到增強(qiáng)，表明Mcl-1在抗細(xì)胞凋亡中起重要作用。
此外，Carmody等用ROS誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)了磷脂酰絲氨酸(PS)外露、DNA片段化、細(xì)胞皺縮及細(xì)胞膜出現(xiàn)囊泡等典型的凋亡特征；同時用TUNEL法也檢測到大量陽性細(xì)胞，但在整個細(xì)胞凋亡過程中，caspases均沒有被激活，使用caspase抑制劑zVAD-fnnk、DEVD-CHO、BD-fmk也沒能阻止凋亡的發(fā)生，表明視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡過程中存在一條不依賴caspase的途徑。Isliisaka等在研究H2O2致HL-60細(xì)胞凋亡的過程中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H2O2濃度在50μmol/L以上時，溶酶體在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮一定的作用，認(rèn)為存在一條溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。氧化應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點，其分子機(jī)制研究才剛剛起步，尚有許多問題需要進(jìn)一步探討。