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孫宇，陳建光
(北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林132013)
北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)
2009年2月第10卷第1期
作者簡介：孫宇(1982-)，女，碩士研究生，主要從事心血管藥理學(xué)研究；
陳建光(1962-)，男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事心血管藥理學(xué)研究。
摘要：
近年來的研究表明，細胞凋亡(apoptosis)與心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusioninjury，MIRI)有著密切關(guān)系。全面了解有關(guān)研究進展，進一步開展相關(guān)的研究，將會為心肌缺血再灌注損傷的防治提供更多的途徑。為此，從細胞凋亡的基本知識、心肌缺血再灌注與細胞凋亡的關(guān)系、藥物干擾作用及研究方法等方面進行了闡述。
近些年來，缺血性心臟病發(fā)病率不斷上升，而隨著各種心血管外科手術(shù)如靜脈溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary interventions，PCI)等方法的廣泛開展，對于恢復(fù)心肌灌注、挽救瀕死心肌或縮小心肌梗死范圍、保護心臟功能起到了很重要的作用，而心臟在缺血和恢復(fù)血流灌注后發(fā)生的病理生理學(xué)改變——缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IR)引起了人們的普遍關(guān)注。
隨著分子心血管病學(xué)研究的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷引起的心肌細胞死亡有兩種機制，即壞死和凋亡，并且凋亡是引起心血管系統(tǒng)疾病的重要原因。心肌再灌注雖然恢復(fù)了血流，但同時也可能加速了受損心肌細胞的凋亡過程。故細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷的病理過程中發(fā)揮著重要的作用。
1細胞凋亡
1．1細胞凋亡的概念
細胞凋亡的原詞apoptosis是來源于希臘語，其含義為“花瓣或樹葉的凋落”。細胞凋亡研究經(jīng)歷了近60年的歷史。早在1950年，發(fā)育生物學(xué)家就通過對蛾變態(tài)的觀察指出，在脊椎動物正常發(fā)育過程中存在著細胞消亡現(xiàn)象，并提出了程序性細胞死亡的概念，認為整個發(fā)育程序是受時間和空間條件控制的。20世紀70年代，科學(xué)工作者應(yīng)用光鏡和電鏡等技術(shù)手段觀察了哺乳動物體內(nèi)形態(tài)學(xué)變化，認識到生理性死亡的形態(tài)學(xué)特征。直到1972年，澳大利亞的病理學(xué)家Kerr等初次從形態(tài)學(xué)上描述了這種不同于壞死的細胞死亡方式。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和對細胞凋亡研究的深入，比較規(guī)范地把細胞凋亡定義為：在一定生理或病理條件下遵循自身程序的主動性細胞自殺，是一個積極的、準確調(diào)控的、要消耗能量的過程。即有核細胞在一些外部死亡信號的刺激下，通過信號傳遞途徑激活內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶，啟動自身內(nèi)部的基因表達和調(diào)控而引發(fā)的連續(xù)性程序化細胞死亡(programmed cell death，PCD)，在整個過程中涉及到一系列特殊基因的表達，隨之細胞發(fā)生特征性的形態(tài)學(xué)和生化變化。
1．2細胞凋亡的特征
作為細胞的一種由基因控制的主動性死亡過程，細胞凋亡有著其獨特的形態(tài)學(xué)特征和生化特征。
1．2．1形態(tài)學(xué)特征
在細胞凋亡早期，先表現(xiàn)為細胞核的一系列形態(tài)變化，細胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮并聚集在核膜的內(nèi)側(cè)呈鐮刀狀(或新月體形)，與其鄰近的核孔消失，此時胞膜結(jié)構(gòu)保持完整，容積皺縮，與鄰近細胞失去聯(lián)系。隨后胞膜起皺，表面不平，呈泡狀突起，細胞質(zhì)和細胞器密度增高，細胞體積縮小變得致密，細胞漿空泡變、固縮，但細胞膜的完整性未遭到破壞。至后細胞膜突出、芽生，形成大小不等的膜包裹的凋亡小體(apoptosis bodies)，內(nèi)含有完整的細胞器和核碎片。凋亡的細胞及碎片可在數(shù)小時內(nèi)很快被附近的吞噬細胞吞噬，不同于細胞壞死的是其并不引起周圍組織的炎性反應(yīng)和繼發(fā)性損傷，因此，又稱為清潔性死亡(clean death)。
1．2．2生化特征
細胞凋亡過程中可出現(xiàn)各種生化改變，其中基因組DNA有規(guī)律的片段化斷裂及蛋白質(zhì)的不可逆性降解尤為重要。凋亡細胞的內(nèi)源性Ca2+、Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活化，將細胞核染色體在核小體連接處切斷，形成180～200bp倍的DNA片段，在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)特征性“NDA梯狀條紋”，因此，稱DNA梯(DNA ladder)。目前認為，這是判斷細胞發(fā)生凋亡的主要標志之一。此外，還有Ⅱ型轉(zhuǎn)谷酰胺酶激活所致的交聯(lián)蛋白質(zhì)網(wǎng)形成和胞漿膜修飾。
2心肌缺血再灌注損傷與細胞凋亡
傳統(tǒng)的觀點認為，心肌細胞和神經(jīng)元等終末分化的不具備再生能力的細胞不會發(fā)生凋亡反應(yīng)，直到1989年初次證實人類心肌細胞也存有凋亡。1993年Eneler等初次從形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方面證實，缺血再灌注心肌中存有凋亡細胞。此后，越來越多的證據(jù)顯示，心肌缺血和再灌注損傷引起心肌細胞凋亡。關(guān)于心肌細胞凋亡的研究起步較晚，其原因有：凋亡過程短暫且不易發(fā)現(xiàn)(持續(xù)約1～3h)；方法學(xué)限制；低估凋亡在心臟病中的作用。近年來，隨著方法學(xué)的進步和凋亡研究的深入，已發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷與細胞凋亡之間有著密切的關(guān)系，并且在心臟的生理、病理發(fā)展過程中起重要作用，被認為是心臟由代償性變化向病理性變化發(fā)展的細胞學(xué)基礎(chǔ)。
2．1細胞凋亡在心肌再灌注損傷中存在的依據(jù)
多項研究證實，缺血再灌注可誘發(fā)心肌細胞凋亡。但是，由于實驗動物的種屬和年齡、實驗?zāi)Ｐ?、心肌缺血及再灌注的時間和程度、凋亡的檢測方法存在一定的差異，所以，目前關(guān)于凋亡是由心肌缺血性損傷所誘發(fā)還是由再灌注損傷所誘發(fā)的問題仍然存在著爭議。
在MIRI中，研究細胞凋亡先見于1994年Gottlieb等的報道，他們利用家兔離體心臟灌注模型，觀察發(fā)現(xiàn)單純?nèi)毖?0 min，4．5 h和缺血5min再灌注4h的心肌細胞均未出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，而缺血30min后再灌注4h則出現(xiàn)心肌細胞凋亡，形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)核染色質(zhì)濃縮，并且有典型的DNA梯狀條帶現(xiàn)象，提示在缺血再灌注后的心肌中存在DNA的核小體間降解即凋亡，因此，認為凋亡是心肌對缺血再灌注損傷的一個特殊反應(yīng)。而Fliss等應(yīng)用在體大鼠心肌缺血再灌注模型，采用原位末端標記法(ISEL)及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)，持續(xù)缺血2h或缺血45min后再灌注1h均有典型的凋亡形態(tài)改變與特征性DNA梯狀條帶，并且隨著再灌注時間的延長，凋亡細胞的數(shù)目增加，且后者的凋亡發(fā)生率(23％)顯著低于前者(33％)，因此，認為缺血和再灌注大鼠心肌均可發(fā)生細胞凋亡。Chakrabarti等在大鼠離體心臟灌注模型上發(fā)現(xiàn)心肌缺血10min即出現(xiàn)心肌細胞凋亡，缺血30min達高峰，證實了缺血可引起心肌細胞凋亡。姚震等研究表明，不同時間的心肌缺血再灌注損傷均可導(dǎo)致心肌細胞凋亡，以缺血30～60min后再灌注時明顯，說明心肌細胞凋亡的發(fā)生率與此前心肌缺血時間長短有關(guān)。趙明中等研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注可減少心肌缺血細胞凋亡，同時也能加速受損心肌細胞的凋亡過程，且凋亡細胞主要位于心肌纖維收縮帶區(qū)域內(nèi)和心肌梗死區(qū)周圍/心肌缺血再灌注后心肌細胞凋亡隨再灌注時間的延長而顯著增多。
在人類心肌梗死尸檢中也發(fā)現(xiàn)梗死灶收縮帶有明顯的細胞凋亡，該細胞凋亡多分布在短暫缺血后血管再通的相鄰部位和梗死灶的收縮帶區(qū)域，病理學(xué)認為，細胞凋亡機制與心肌短暫缺血后再灌注損傷密切相關(guān)。Bardales等運用原位凋亡檢測方法對因明顯心肌梗死者、可疑早期心肌梗死者和沒有心肌梗死者的心臟標本中心肌細胞的凋亡情況進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有明確診斷為心肌梗死的心肌細胞均出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，可疑者為97％出現(xiàn)細胞凋亡，而沒有心肌梗死者則僅為8％，因此，認為缺血再灌注損傷中有細胞凋亡參與，且再灌注可以加速不可逆轉(zhuǎn)的細胞凋亡，而且心肌細胞的凋亡與缺血再灌注持續(xù)時間長短有關(guān)。
綜上所述，目前認為，缺血再灌注過程中有明確的細胞凋亡參與，細胞凋亡加重了缺血再灌注損傷。長時間持續(xù)性缺血和再灌注均可誘發(fā)心肌細胞凋亡，尤其是再灌注后細胞內(nèi)ATP水平迅速恢復(fù)，胞漿和線粒體內(nèi)鈣超載，以及自由基大量生成，更是加速了不可逆性細胞凋亡的發(fā)生。
2．2細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中的作用
由于再灌注期間凋亡細胞主要是出現(xiàn)在壞死心肌的周圍區(qū)域，所以提示凋亡可能在缺血再灌注后心肌梗死范圍的擴大中發(fā)揮著一定的作用。為此，有研究人員采用核酸內(nèi)切酶抑制劑——金精三羧酸(aurintricarboxylic acid，ATA)分析了凋亡在缺血再灌注后心肌梗死中的作用。結(jié)果顯示，在犬冠狀動脈梗阻1h再灌注24h模型上，再灌注開始時采用ATA處理可明顯減少壞死組織周圍區(qū)凋亡心肌細胞的數(shù)目，同時伴有特征性“DNA梯狀條紋”的缺失。這種凋亡程度的降低主要是與Bcl-2上調(diào)以及Bax和細胞凋亡蛋白酶(Caspsase-3)活性降低有關(guān)。更為重要的發(fā)現(xiàn)是，ATA所致的心肌凋亡抑制可明顯縮小心肌梗死的面積。因此，抑制細胞凋亡的發(fā)生不僅有助于減輕缺血再灌注心肌的壞死性損傷，而且還可改善心臟的機械收縮功能。
上述研究充分說明，細胞凋亡和細胞壞死之間存在著一定的交叉和聯(lián)系，抑制心肌細胞凋亡的發(fā)生可能是臨床上有效防治心肌缺血再灌注損傷的一條重要途徑。
3心肌缺血再灌注過程中細胞凋亡的發(fā)生機制
心肌細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中所起的作用越來越引起人們的重視，但確切機制還不清楚。
細胞凋亡是一個很復(fù)雜的過程，其觸發(fā)機制尚不清楚。細胞增殖劑可促進已進入細胞周期的增殖型細胞增殖，但啟動終末分化細胞的凋亡。心肌細胞是非增殖型細胞，已不能進行細胞分裂進入細胞周期，但在一定因素的刺激下仍可跨過G1/S期限制點屏障進入細胞周期，發(fā)生分裂增生，并引發(fā)細胞凋亡。Kajstura等觀察到在急性心肌梗死(AMI)時心肌細胞發(fā)生凋亡時確實存在S期細胞突然增多的現(xiàn)象。
細胞凋亡區(qū)別于細胞壞死的一個顯著特征即受基因調(diào)控，是機體在內(nèi)外環(huán)境刺激下啟動的由基因調(diào)控的細胞死亡過程。心肌缺血/再灌注損傷過程中，心肌細胞凋亡的發(fā)生同樣受到細胞周圍刺激信號的誘導(dǎo)，并且由特定的凋亡相關(guān)基因所控制，細胞凋亡的發(fā)生機制目前仍未完全闡明，可能與以下因素有關(guān)。
3．1缺血再灌注損傷中細胞凋亡的相關(guān)調(diào)控基因
盡管對缺血/再灌注損傷中細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制還不甚明確，但資料表明，bcl-2家族、p53、Fas抗原及腫瘤壞死因子(TNF-α)等參與了細胞凋亡的調(diào)節(jié)。
細胞凋亡的調(diào)控基因分為誘導(dǎo)基因(死亡基因)和抑制基因(生存基因)。在生理條件下，心肌細胞有序而協(xié)調(diào)地激活凋亡誘導(dǎo)基因(Bax、Fas、p53等)和/或凋亡抑制基因(Bcl-2等)，共同調(diào)控細胞代謝而維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。但在缺血再灌注過程中，凋亡相關(guān)基因及其表達產(chǎn)物發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致心肌細胞凋亡的發(fā)生。在調(diào)控凋亡的基因中，目前研究較多的是Bcl-2基因家族。
3．1．1 Bcl-2基因的作用
Bcl-2是一種原癌基因，具有促進細胞生存、抗凋亡作用。Bcl-2家族是先被注意到與細胞凋亡有密切關(guān)系的基因之一，1984年由Nakmaura等先在B細胞濾泡性淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的抗細胞凋亡基因，在缺血再灌注損傷中表現(xiàn)得尤為突出。按其功能可分為抗凋亡的Bcl-2亞族(包括Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w，Mcl-1，Nr-13等)和促凋亡的Bax亞族(包括Bax、Bak、Bid、Bad、Bik、Bnips等)，Bcl-2和Bax是其中尤其重要的成員。Bcl-2家族在心肌缺血再灌注損傷所致細胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
Xie等研究了Bcl-2和Bax在大鼠缺血再灌注損傷心肌的再灌注區(qū)和非再灌注區(qū)表達的不同，在再灌注區(qū)未發(fā)現(xiàn)Bcl-2表達，而Bax表達增加，表明該區(qū)心肌有發(fā)生凋亡的趨勢；在非再灌注區(qū)Bcl-2表達明顯增加，這可能是尚存活的心肌的一種自我保護機制。Zhao等研究了結(jié)扎犬冠狀動脈左前降支1 h后分別再灌注6、24、48、72h對心肌細胞表達Bcl-2和Bax的影響，結(jié)果為隨著再灌注時間延長Bcl-2表達逐漸減少，而Bax表達逐漸增多，相應(yīng)地心肌細胞凋亡指數(shù)也隨再灌注時間延長而增加。上述結(jié)果提示心肌缺血再灌注后局部心肌表達Bcl-2和Box的多少可影響心肌細胞凋亡的嚴重程度，提高Bcl-2/Bax比率能減少心肌細胞凋亡。
抗細胞凋亡的作用機制有以下幾方面：
1)抑制Ca2+的釋放。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法發(fā)現(xiàn)，Bcl-2高表達可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，故Bcl-2對細胞凋亡的抑制作用可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+有關(guān)。鈣泵特異性抑制劑TG誘導(dǎo)的WEH17．2等細胞凋亡可被Bcl-2抑制，其原因是Bcl-2抑制了鈣離子的跨膜流動，提示Bcl-2可通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度來調(diào)節(jié)凋亡。
2)Bcl-2通過阻止促細胞凋亡基因信號傳遞或阻止這些誘導(dǎo)基因產(chǎn)物發(fā)揮作用。
3)細胞內(nèi)抗氧化作用。Bcl-2可通過抑制氧自由基而發(fā)揮抗細胞凋亡作用。在去除生長因子所誘發(fā)的凋亡中，活性氧是觸發(fā)細胞死亡的主要誘因，Bcl-2的過度表達可減少氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化物的形成。這些發(fā)現(xiàn)提示，Bcl-2可能通過抗氧化來抑制細胞凋亡。
同一基因家族的成員何以具有兩種截然不同的功能尚有待進一步觀察。
3．1．2 P53基因
p53基因是有名的抗癌基因，參與細胞周期調(diào)控和DNA修復(fù)。p53是細胞生長過程中的分子感受器，監(jiān)測細胞的DNA狀態(tài)，起到分子警察的作用。當(dāng)細胞的DNA損傷時，p53使細胞分裂停止于G1期，即p53表達增加使細胞中止增殖以便使損傷的DNA進行修復(fù)取得時間；如果DNA受損嚴重?zé)o法修復(fù)，則p53蛋白持續(xù)增高，導(dǎo)致細胞凋亡?？梢?，p53實質(zhì)上是一種“分子警察”。正常的p53基因可分為野生型和突變型兩種，即野生型P53基因(wt-p53)與突變型p53基因(m-p53)均參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)。野生型p53基因能誘導(dǎo)促進細胞的凋亡，突變型p53則抑制細胞凋亡。
近年來，人們發(fā)現(xiàn)p53與細胞凋亡有密切關(guān)系。齊麗彤等應(yīng)用Wistar大鼠結(jié)扎左冠狀動脈45 min再灌注4 h，觀察到缺血再灌注過程中心肌細胞P53表達增加。Kirshenbaum等研究心肌細胞凋亡的分子調(diào)節(jié)機制，結(jié)果證實，p53基因為心肌細胞凋亡的激活因子，并且指導(dǎo)促凋亡基因Bax的轉(zhuǎn)錄，而且由P53激活的心肌細胞凋亡可以被抗凋亡基因Bcl-2所阻斷，支持了Bcl-2是一個強有力的抗凋亡因子。
3．1．3 Fas/Apo-1抗原家族
Fas又稱Apo-1或CD95，是位于細胞膜上的一個腫瘤壞死因子受體/神經(jīng)生長因子受體超家族成員，廣泛分布于各種組織細胞中，屬Ⅰ型膜蛋白，由胞外區(qū)、穿膜區(qū)和胞漿區(qū)組成，主要通過Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)細胞凋亡。心肌缺血缺氧能引起凋亡促進因子Fas表達升高。
Fas介導(dǎo)的細胞凋亡需要其天然配體FasL參與。Fas誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的機制有兩種解釋，一為Fas抗原作為細胞表面受體，與FasL或抗Fas抗體結(jié)合，誘導(dǎo)酸性神經(jīng)鞘磷酸酶的活化，分解神經(jīng)鞘磷脂，釋放神經(jīng)酞胺，隨后神經(jīng)酞胺可通過膜結(jié)合性的蘇氨酸或絲氨酸蛋白激酶等激活第二信使途徑，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣離子濃度增高，誘導(dǎo)多種生化反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生。二為從Fas受體，經(jīng)Caspsase的調(diào)節(jié)?；罨疛NK和p38-k，再通過某種方式激活第二信使途徑，使細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，進而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。
實驗發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注后梗死周邊區(qū)發(fā)現(xiàn)有大量Fas受體表達，經(jīng)既是抗氧化劑又是β受體阻滯劑的卡維地洛處理后，梗死周邊區(qū)凋亡細胞數(shù)目減少77％，同時Fas受體表達顯著降低，與野生型小鼠相比，缺乏功能性Fas的小鼠離體心臟缺血再灌注損傷明顯減輕。以上結(jié)果提示，F(xiàn)as具有促進凋亡發(fā)生的作用。趙明中等實驗證實，心肌缺血再灌注后Fas基因的RNA及蛋白表達均增多，且隨心肌缺血或再灌注時間延長而增加。通過比較研究體外培養(yǎng)的鼠新生心肌細胞和非心肌細胞在缺氧情況下的細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)缺氧后12h心肌細胞的DNA就發(fā)生降解，而非心肌細胞在缺氧72h后仍沒有發(fā)生類似現(xiàn)象，同時心肌細胞Fas的mRNA表達上調(diào)2倍，相反非心肌細胞Fas的mRNA則呈下降趨勢，表明缺氧引起的Fas表達增加可能是其引起心肌細胞凋亡的主要機制。進一步研究發(fā)現(xiàn)新生大鼠心室肌細胞在缺氧的情況下給予重組的FasL，能明顯增加心肌細胞的凋亡，并且伴有Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白等明顯增加，而在正常供氧條件下則無上述改變。Fas及Fas-L蛋白陽性表達細胞的分布與心肌凋亡細胞的分布趨勢一致進一步顯示了它們之間的關(guān)系密切，表明Fas、Fas-L系統(tǒng)在缺血再灌注后心肌細胞凋亡中有重要意義。
3．1．4核因子NF-κB的作用
NF-κB是Rel蛋白家族成員，由多肽p50和p65亞基形成p50和p65同源二聚體及p50-p65異源二聚體，其中發(fā)揮主要生理功能的是p50-p65異源二聚體。NF-κB多位于細胞的胞漿中，缺血再灌注期間它可被細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-17激活，其中過氧化物對NF-κB的激活更為重要；NF-κB激活后能調(diào)節(jié)多種細胞因子的表達，如IL-6、IL-8、TNF-α及粘附分子ICAM-1，VCAM-1H和ELAM-1的表達，因而具有重要的作用。
NF-κB與細胞凋亡的關(guān)系尚未明確，NF-κB具有抗細胞凋亡作用，它能抑制caspase-8；從其能上調(diào)許多有害細胞因子的作用來看，NF-κB能促進細胞凋亡。總之，NF-κB在缺血再灌注損傷中的作用尚未闡明，對缺血再灌注組織的細胞凋亡有何調(diào)節(jié)作用亦不清楚。
3．1．5半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase家族)
Caspsase是一個特殊的蛋白水解酶家族，全稱是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)14種。這類蛋白酶具有半胱氨酸蛋白酶類和特異酶切Asp氨基位點兩大特點，其與心肌細胞凋亡的關(guān)系是近年研究的熱點之一。Caspsase家族主要在凋亡的執(zhí)行階段起主要作用，凋亡的發(fā)生是一系列Caspsase家族成員共同參與完成的，它們的活性部位含半胱氨酸，于底物ASP部位產(chǎn)生特異性水解。在眾多Caspsase成員中，Caspsase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的Caspsase家族中的關(guān)鍵蛋白酶。Caspase-3引起DNA損傷修復(fù)酶降解，同時激活核酸內(nèi)切酶，從而使細胞凋亡。Caspsase-3可被該家族其他成員活化，簡而言之，多種多樣刺激因素啟動的信號激活Caspsase-3?；罨腃aspsase-3可作用于一些其他Caspsase成員，以瀑布式活化，引起細胞形態(tài)上的改變，使凋亡終得以完成。因此，Caspsase-3是凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。正常狀態(tài)下無活性形式存在于組織中，經(jīng)凋亡信號刺激活化，導(dǎo)致凋亡細胞解體，能酶解滅活凋亡抑制物，被認為是凋亡過程中關(guān)鍵的通路，但并非是僅有的通路。
有學(xué)者研究表明，Caspsase-3對線粒體有正反饋作用，而且對于已經(jīng)決定走向凋亡的細胞來說，在僅僅依靠Caspsase-3初始激活后對凋亡信號級聯(lián)反應(yīng)下游蛋白的水解作用還不能引起細胞凋亡的情況下，必須依靠Caspsase-3對線粒體的反饋作用來放大凋亡信號的力度，破壞更多的線粒體，使其能量和氧化還原電勢下降，為線粒體滲透性轉(zhuǎn)運孔道(mitochrondrial permeability transition pore，MPTP)進一步開放和細胞色素C的釋放創(chuàng)造條件，使凋亡不可逆轉(zhuǎn)。曾志勇等在貓的體外循環(huán)實驗中發(fā)現(xiàn)，再灌注15 min時心肌Caspsase-3 mRNA的表達量較主動脈阻斷前明顯增加，再灌注90min時心肌Caspsase-3 mRNA的表達量為主動脈阻斷前的4倍，徐強等研究大鼠心肌再灌注不同時相Caspsase-3激活與心功能變化的關(guān)系，提出Caspsase-3激活是MIRI后心肌細胞凋亡導(dǎo)致心功能下降的機制之一。據(jù)此，對半胱氨酸蛋白酶，尤其是Caspsase-3表達的研究有助于進一步了解MIRI心肌細胞凋亡病理過程的規(guī)律，亦為通過抑制細胞凋亡防治MIRI提供了新的位點。
在大鼠和家兔的心肌缺血再灌注模型上應(yīng)用ZVDA-fmk(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑)后表現(xiàn)為心肌原位缺口末端標記法陽性細胞數(shù)減少，心肌梗死面積減少。過度表達心臟特異性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為心臟功能減退，心肌梗死面積增加，細胞核、線粒體和肌纖維的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但并未觀察到凋亡細胞的特征物“凋亡小體”。以上結(jié)果提示，凋亡的發(fā)生是一組半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果。
Caspsase一旦被激活，便可經(jīng)過以下3條途徑引發(fā)細胞凋亡：
1)影響DNA的代謝和修復(fù)機制。
2)作用于維持細胞正常形態(tài)的蛋白成分。
3)作用于與細胞凋亡有關(guān)的基因。
因為該酶在細胞凋亡中起著滅活細胞凋亡的抑制物與促進細胞凋亡的重要作用。
3．1．6 HSP70
HSP70(Hot Shock Protein 70，熱休克蛋白70)是一組在外界刺激下維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的自身保護蛋白，作為真核細胞尤其重要的分子伴侶，在蛋白質(zhì)折疊、裝配、轉(zhuǎn)運和降解過程中起著重要作用。研究表明，轉(zhuǎn)染HSP70的轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)歷缺血再灌注后，心肌細胞凋亡指數(shù)顯著降低；對轉(zhuǎn)染HSP70和(或)HSP60的新生大鼠心肌細胞進行缺氧/復(fù)氧打擊，發(fā)現(xiàn)Caspase-3活性降低、胞質(zhì)中細胞色素C含量減少，心肌細胞凋亡指數(shù)減少。
3．2心肌細胞凋亡的外部誘發(fā)因素
在心肌缺血再灌注的過程中，炎癥細胞、血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞之間發(fā)生異常的相互作用，通過釋放大量的可溶性炎癥介質(zhì)和介導(dǎo)細胞內(nèi)鈣超載而影響心肌細胞生存的微環(huán)境，從而誘發(fā)心肌細胞凋亡。
3．2．1中性粒細胞浸潤
近20余年的臨床與基礎(chǔ)研究證明，缺血再灌注所致的心肌細胞凋亡中大量中性粒細胞聚集，與缺血再灌注心肌的損傷程度密切相關(guān)。
在再灌注早期，中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞上的粘附因子結(jié)合，釋放許多具有趨化作用的炎癥介質(zhì)，并可級聯(lián)放大，促使血管內(nèi)皮細胞收縮，血管通透性增加，誘導(dǎo)細胞粘附分子(ICAM)以及血管細胞粘附分子(VCAM)廣泛表達，促使中性粒細胞粘附、滾動、激活和穿過血管壁游走，通過產(chǎn)生的超氧自由基和蛋白水解酶等多種機制造成血管功能障礙及組織損傷，進而吸引更多的中性粒細胞、血小板，發(fā)揮趨化作用，促進中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞更廣泛的粘附，導(dǎo)致“無復(fù)流現(xiàn)象”形成。隨著再灌注時間的延長，中性粒細胞逐漸遷移進入細胞間隙而直接與心肌細胞發(fā)生細胞間相互作用，誘發(fā)心肌損傷。在誘發(fā)心肌細胞凋亡的過程中，中性粒細胞活化亦同樣扮演著尤其重要的角色。
研究顯示，在大鼠心肌缺血45min再灌注4h引起的凋亡心肌細胞中，采用髓過氧化酶(MPO)活性來測定中性粒細胞的含量發(fā)現(xiàn)，其含量為正常心肌組織的3倍。采用在體大鼠心肌梗死模型的另一項研究同樣顯示，中性粒細胞在再灌注心肌中聚集增加可加重心肌細胞凋亡的程度。在犬和大鼠局部心肌缺血再灌注模型進行的研究發(fā)現(xiàn)，危險區(qū)中性粒細胞聚集與凋亡細胞數(shù)目的增加呈線性關(guān)系，提示中性粒細胞與心肌細胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。
但是，關(guān)于中性粒細胞如何介導(dǎo)心肌細胞凋亡的發(fā)生機制目前尚不十分清楚，可能是由于中性粒細胞聚集堵塞微血管而導(dǎo)致無復(fù)流現(xiàn)象，亦可能與中性粒細胞活化后釋放大量的炎性介質(zhì)(例如自由基和細胞因子)有關(guān)。因此，對于中性粒細胞在再灌注誘發(fā)的心肌細胞凋亡中的直接作用機制，尚需做進一步的研究。
3．2．2氧化應(yīng)激增強
活性氧(active oxygen)是活潑的氧自由基和具有氧自由基反應(yīng)性的其他含氧物質(zhì)的總稱，故又稱反應(yīng)性氧類(reactive oxygen species，ROS)。活性氧包括超氧陰離子自由基(O2-·)、羥自由基(·OH)、單線態(tài)氧(1-O2)和過氧化氫(H2O2)等氧自由基。在生理狀態(tài)下，機體需要不斷地產(chǎn)生自由基參與正常代謝過程，多余的自由基可及時地被清除，其產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡?；钚匝跤泻軓姷难趸钚裕善茐臋C體氧化/還原動態(tài)平衡，造成生物大分子(核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì))的氧化損傷。凋亡是機體氧化損傷的后果之一。
心肌缺血再灌注時可產(chǎn)生大量的氧自由基。氧自由基(OFR)含量增高明顯，生物膜脂質(zhì)過氧化。蛋白質(zhì)變性以及合成障礙，線粒體損傷，組織水腫，酶受體和離子通道活性及結(jié)構(gòu)改變，從而造成心肌損傷。在心肌缺血再灌注過程中，心臟可通過下列途徑產(chǎn)生大量的氧自由基：
1)中性粒細胞是氧自由基產(chǎn)生的一個重要途徑。缺血期間，活化的中性粒細胞可在促炎因子的刺激下聚集到缺血組織，細胞因子轉(zhuǎn)錄和表達增加，促使細胞膜脫顆粒，釋放蛋白水解酶，炎癥浸潤線粒體，致使呼吸鏈電子傳遞受損，耗氧量增加；隨著再灌注期間O2的重新供應(yīng)，所攝取的氧通過NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生超氧陰離子，然后在嗜苯胺藍顆粒釋放的髓過氧物酶(MPO)的催化作用下，超氧陰離子可快速異常地產(chǎn)生大量過氧化氫、氫自由基和次氯酸通過上調(diào)嘌呤氧化酶和一氧化氮合成酶的活性，內(nèi)皮細胞和成纖維細胞可合成和釋放大量的氧自由基。
研究顯示，氧自由基是啟動凋亡的重要因子，采用抗氧化劑和自由基清除劑可有效抑制細胞凋亡的發(fā)生。Anlborsoi等通過在體犬心肌缺血再灌注模型進行研究發(fā)現(xiàn)，重組人超氧化物歧化酶可明顯減少心肌缺血再灌注所誘發(fā)的TUNEL陽性細胞。Galang等通過研究亦發(fā)現(xiàn)，給予SOD和過氧化氫酶可消除缺血再灌注所誘發(fā)的心肌細胞凋亡。
前面提到缺血再灌注期間，尤其在再灌注期間組織內(nèi)氧自由基大量產(chǎn)生，它可能通過以下途徑誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡：
1)氧化破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜的完整性而導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載，引起脂質(zhì)過氧化，從而影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，激發(fā)有關(guān)調(diào)控基因，導(dǎo)致細胞凋亡。
2)粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放而釋放cytoC。
3)直接損傷DNA，激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB，后者可通過上調(diào)TNF-α和白介素-6而誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的發(fā)生。
4)攻擊蛋白質(zhì)，使許多蛋白質(zhì)尤其是具有酶活性的蛋白質(zhì)功能喪失。心肌缺血缺氧可使內(nèi)源性抗氧化劑如SOD失活或耗盡，導(dǎo)致ATP代謝產(chǎn)物在心肌組織中堆積，產(chǎn)生大量ROS，使細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡，誘導(dǎo)某些基因的表達，引起細胞凋亡。
3．2．3細胞內(nèi)鈣超載
近年來，關(guān)于Ca2+細胞功能的研究報道很多，游離Ca2+是信號傳遞途徑的成員之一，并認為細胞內(nèi)鈣超載及其所觸發(fā)的一系列有害代謝是導(dǎo)致心肌細胞死亡的“至后共同通路”，在細胞凋亡中有重要作用。
心肌缺血缺氧期，由于Na+-K+-ATP酶活性降低，使ATP生成減少，影響離子的跨膜轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致胞漿及線粒體內(nèi)Na+超載，后者激活細胞質(zhì)膜上的Na+-Ca2+交換蛋白，因而在再灌時隨著Na+外移，大量Ca2+進入細胞內(nèi)，形成細胞內(nèi)Ca2+超載現(xiàn)象。缺血再灌注期間多種因素造成細胞內(nèi)Ca2+超載，Ca2+作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的第二信使，在細胞凋亡過程中起著重要的作用。
鈣超載Ca2+誘導(dǎo)細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制有：
1)細胞內(nèi)Ca2+濃度升高后可激活內(nèi)源性Ca2+、Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶，使細胞核內(nèi)雙鏈DNA在核小體Linker部位降解成寡核苷酸片段。
2)鈣超載可直接調(diào)節(jié)某些Ca2+敏感蛋白酶活性，如核骨架蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、拓撲酶Ⅱ、磷脂酶等。
3)Ca2+可激活蛋白激酶C，激發(fā)或促進細胞凋亡，令其轉(zhuǎn)移到細胞膜，使G-蛋白磷酸化，G-蛋白減少，胞內(nèi)cAMP增加，導(dǎo)致細胞凋亡。
4)Ca2+還可調(diào)節(jié)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的活性，使大量蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，在脂質(zhì)膜下形成蛋白質(zhì)網(wǎng)，防止胞漿內(nèi)成分外漏，避免了像壞死所致的炎癥反應(yīng)。而且，轉(zhuǎn)谷酰胺酶還參與了胞漿膜的修飾，從而有利于吞噬細胞識別形成的凋亡小體而將其吞噬。
5)線粒體內(nèi)大量Ca2+聚集，引起線粒體內(nèi)膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔開放，釋放細胞色素C入人胞質(zhì)內(nèi)，進一步激活Caspsase誘致細胞凋亡。應(yīng)用Ca2+通道阻斷劑硝苯地平能拮抗Ca2+所致的心肌細胞凋亡。
事實上，細胞內(nèi)鈣離子超載及氧自由基的過量產(chǎn)生是同一病理生理過程中的兩種不同現(xiàn)象，且兩者存在互為因果關(guān)系。細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的氧自由基可直接損傷細胞膜，導(dǎo)致細胞膜通透性增加，鈣離子內(nèi)流。而細胞內(nèi)鈣離子濃度增高，又可激活鈣離子依賴性蛋白酶，后者可催化黃嘌呤脫氫酶(XDH)轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶(XOD)，而XOD在有氧條件下能促進次黃嘌呤分解為尿酸的同時產(chǎn)生大量的氧自由基。因此，在對缺血再灌注損傷致細胞凋亡的機制認識上不可將兩者分開。
3．2．4一氧化氮及一氧化氮合酶
一氧化氮(nitric oxide，NO)是由血管內(nèi)皮合成并釋放的一種內(nèi)源性舒張因子，是體內(nèi)一種重要的生物信號分子，在心血管生理學(xué)和病理學(xué)過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。大量的NO具有細胞毒性作用，在體內(nèi)缺氧狀態(tài)下，巨噬細胞、中性粒細胞、心肌細胞等均可激活誘生型NO合成酶(induciblenitric oxide synthase，iNOS)產(chǎn)生超劑量的NO，干擾能量代謝、直接損害DNA、激活多聚ADP核糖聚合酶或擾亂細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，從而引起細胞損傷，導(dǎo)致細胞凋亡。
但NO也是一種細胞保護因子，NO可分別通過cCGMP與cAMP途徑降低細胞內(nèi)Ca2+濃度或阻斷Ca2+內(nèi)流，通過平滑肌細胞舒張等多種途徑起到減少心肌再灌注損傷的作用。這些保護作用均由結(jié)構(gòu)型NO合酶(Constitutivenitric oxide synthase，cNOS)完成。所以，NO在心肌缺血再灌注過程中是發(fā)揮促進細胞凋亡還是抑制細胞凋亡的作用，可能取決于NO在心臟內(nèi)發(fā)揮作用的濃度和心臟的氧化還原狀態(tài)。不同的實驗方法可能會出現(xiàn)完全不同的實驗結(jié)果。
3．2．5細胞因子與粘附分子大量表達
細胞因子是體內(nèi)白細胞及其他不同的細胞分泌的一類小分子水溶性蛋白質(zhì)，具有多種細胞調(diào)節(jié)活性。在心肌缺血再灌注損傷中，活化的巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞以及心肌細胞本身可產(chǎn)生大量的細胞因子和粘附分子。細胞因子不僅可促進心肌炎癥，而且還可與粘附分子相互作用而加重心肌細胞凋亡。白細胞介素-1(IL-1)，白細胞介素-6(IL-6)，白細胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)都參與了心肌缺血再灌注的損傷。
TNF-α是一類具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子，目前有關(guān)TNF-α在心肌細胞凋亡誘導(dǎo)中作用的研究較多。在缺血和再灌注期間，心肌細胞內(nèi)的TNF-α表達明顯上調(diào)。徐世安等應(yīng)用大鼠Langendorff離體心臟灌注模型，通過酶聯(lián)免疫法測定心肌組織TNF含量，原位雜交檢測TNFmRNA的表達情況。結(jié)果顯示缺血再灌注心肌的TNF水平明顯升高，并且TNFmRNA也出現(xiàn)表達。
多項研究顯示，TNF-α可通過下列機制誘發(fā)心肌細胞凋亡：
1)與其受體TNFRI結(jié)合后，直接激活心肌細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
2)激活酸性鞘磷脂酶，通過產(chǎn)生脂質(zhì)信使神經(jīng)酰胺而介導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生。
3)誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞和部分心肌細胞表達IL-1、IL-2、IL-6、細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM1)和血小板活化因子，促進中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的粘附和脫顆粒，并激活NADPH氧化酶而釋放氧自由基，從而間接地調(diào)控凋亡過程。
4心肌細胞凋亡的研究方法
基于凋亡細胞獨特的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征，我們可以將凋亡細胞與活細胞和壞死細胞區(qū)別開來。心肌細胞凋亡是一個非常復(fù)雜的過程，凋亡散在心壁中，并且限制于單個細胞中，整個凋亡過程歷時短暫。用凋亡誘導(dǎo)因素處理心肌細胞，細胞很快開始皺縮，并且在幾分鐘內(nèi)伴隨著細胞表面以出芽方式生成凋亡小體。如果凋亡小體沒有被吞噬掉，它們在心肌組織中也只保留幾個小時，由于從凋亡開始到凋亡結(jié)束的時間相當(dāng)短，因此，即使是在某種情況下，凋亡的比例相當(dāng)高，能夠觀察到的也只是小部分。由于心肌細胞凋亡時程短暫不易觀察，再加上方法學(xué)的限制，使心肌細胞凋亡的研究相對滯后。目前，對心肌細胞凋亡的研究，主要采用形態(tài)學(xué)特征檢測法、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、組織化學(xué)及分子生物學(xué)方法來進行定性、定量研究。
4．1形態(tài)學(xué)特征研究方法
檢測細胞凋亡的方法種類很多，形態(tài)學(xué)是鑒定細胞凋亡尤其可靠的方法，簡便而適用。
4．1．1光學(xué)顯微鏡
觀察細胞形態(tài)特征，如細胞縮小、核質(zhì)固縮聚集、形成小體及吞噬現(xiàn)象等。但一般只能作細胞凋亡的推測，不具有診斷價值，因為在光鏡下某些類型的細胞壞死(如凝固性壞死)與細胞凋亡的形態(tài)相似，難于區(qū)別。
4．1．2熒光顯微鏡
胞膜完整的活細胞對陽離子染料如臺盼藍、碘化丙咤(PI)、溴化乙錠E(B)、氨基放線菌素D(7AAD)等有拒染能力，但壞死細胞(包括凋亡后期的繼發(fā)性壞死細胞、機械損傷細胞等)可被上述染料標記。細胞凋亡的早期細胞膜雖然尚完整，但可出現(xiàn)細胞膜轉(zhuǎn)運功能一過性的損失，這個階段凋亡細胞與正?；罴毎啾?，可對上述幾種染料的攝取量增加，但又不如凋亡后期細胞那樣明顯或深染，此時結(jié)合其他方法，可較好地區(qū)分早期或晚期的凋亡細胞和正常細胞。
4．1．3電子顯微鏡
雖然光學(xué)顯微鏡下可以看見胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體，但凋亡細胞的形態(tài)學(xué)變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu)，因此，用光鏡觀察難以令人滿意，而透射電鏡可清楚地觀察到細胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時期的變化。電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡更經(jīng)典、可靠的方法，被認為是確定細胞凋亡的金標準。
缺點：
1)只能定性，不能定量。
2)標本處理過程復(fù)雜，設(shè)備相對昂貴，對檢查者的技術(shù)水平要求較高，不適于大批標本檢測。
3)在組織切片上進行電鏡觀察時，有時凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別，因為兩種情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時進行熒光染色，可彌補電鏡檢查的不足。
4．1．4激光共聚焦顯微鏡
激光共聚焦顯微鏡是20世紀80年代發(fā)展起來的新型儀器，它在熒光顯微鏡基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計算機進行圖像處理，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖像。在細胞凋亡研究方面，借助激光共聚焦顯微鏡可以更清楚地觀察到細胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，對凋亡細胞固縮染色質(zhì)和核碎片進行定位，借助熒光標記還可以了解凋亡細胞內(nèi)部的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，實時檢測細胞內(nèi)環(huán)境的各種動態(tài)變化。
4．2生物化學(xué)特征研究方法
生物化學(xué)特征檢測法檢測細胞凋亡的依據(jù)是：在細胞凋亡過程中，染色質(zhì)DNA在核酸內(nèi)切酶的作用下，于核小體之間被切斷，從而形成以180～200bp為基本單位、長度不一的一系列寡核苷酸片段。
4．2．1瓊脂糖凝膠電泳法
瓊脂糖凝膠電泳法是更早用于研究Apoptosis生物化學(xué)變化特征的方法。通過瓊脂凝膠電泳的典型DNA梯形譜可檢測凋亡。而且這種方法不能提供單個細胞或相關(guān)細胞的組織學(xué)定位或細胞分化等凋亡信息。目前該方法已經(jīng)逐漸被新的方法所取代。此方法是判斷細胞有無凋亡發(fā)生的一種簡便方法，比較適用于體外培養(yǎng)的非增殖性細胞的檢測。
細胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA后，進行瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色。瓊脂糖凝膠電泳法常規(guī)是以苯酚氯仿對180～200bp的單位或180～200bp倍數(shù)的DNA寡聚體進行去組蛋白純化，將純化后的雙鏈NDA片段點樣于含有溴化乙錠(EB)的1．5％～1．8％瓊脂糖凝膠電泳中直接進行電泳分析。在凋亡細胞群中可以觀察到典型的呈特征性的“梯狀”電泳圖譜。
缺點：
1)特異性較差，特征性的180～200bpDNA梯帶的出現(xiàn)并非凋亡所僅有，另外，ApoptosisDNA鏈斷裂包括單鏈和雙鏈的斷裂，當(dāng)單鏈斷裂時不出現(xiàn)典型的DNA梯形譜。
2)不能提供單個細胞或相關(guān)細胞的組織學(xué)定位或細胞分化等凋亡信息。
3)不能進行準確定量，只能進行半定量。
4)靈敏性較差。
5)適用于只含有單一細胞成分標本的測定，對組織細胞組成復(fù)雜者，不能確定凋亡發(fā)生于哪類細胞。
4．2．2原位末端標記法(TUNEL法)
原位末端標記法是細胞凋亡時DNA裂解，在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下，在核小體單位間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚，DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TDT)的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測。通常采用的有兩種方法：一種是末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記法；一種是DNA聚合酶或Klenow大片段介導(dǎo)的原位缺口平移法(In situ nicktranslation，ISNL)。
TUNEL實驗可以在培養(yǎng)細胞、石蠟包埋或冰凍切片上進行，因此，具有較好的定位作用。此法既可定性，又能定量，還可動態(tài)觀察凋亡細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。只要凋亡的細胞DNA中有一定量的斷裂點形成，就可以出現(xiàn)陽性反應(yīng)，因此敏感性較高。但也存在假陽性問題。缺點是實驗方法復(fù)雜、費時，每次只能處理少量樣本。這種方法實質(zhì)上是分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，已廣泛用于心肌細胞凋亡研究中。
4．2．3免疫法
1)ELISA檢測法：此法主要是測定核小體。根據(jù)細胞凋亡時DNA斷裂后產(chǎn)生的各核苷酸小體與核組蛋白H2A、H2B、H3H緊密結(jié)合成復(fù)合物，基于定量間接酶標免疫鑒定原理，利用抗DNA的單克隆和抗組蛋白抗體進行檢測的方法。目前也有開發(fā)的檢測試劑盒出售。該法敏感性高，不需特殊儀器，不需提取DNA，適合基層工作單位使用，但不能準確測定凋亡細胞的絕對量。
2)活性Caspsase免疫組化檢測：Caspsase為ICF/Ced-3家族的統(tǒng)稱，直接參與凋亡的早期啟動、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及凋亡晚期事件，因而檢測激活的Caspase可反映細胞凋亡，用于特異性檢測的系列抗體。除免疫組化外，也可用免疫細胞化學(xué)、Western blot及ELISA等方法檢測Caspsase，測定早期和晚期細胞凋亡。
4．2．4流式細胞儀檢測法(flowcytometry，F(xiàn)CM)
細胞凋亡的流式細胞儀檢測法是一種可以對單個細胞或其他生物微粒進行快速定量分析與分選，是定量檢測細胞凋亡的重要方法。用FCM檢測凋亡細胞時，必須用熒光染料對細胞進行染色，并要求細胞呈懸浮狀態(tài)，它能進行細胞DNA和RNA含量分析、細胞周期分析、細胞表面標志分析及細胞受體分析等，但對樣品處理要求較高。
基本原理：細胞出現(xiàn)凋亡時，在細胞學(xué)上發(fā)生一系列特征性改變，如細胞周期停滯、DNA梯度降解、細胞膜通透性增加及細胞DNA和蛋白質(zhì)含量降低等，通過在代謝、生物化學(xué)及分子水平對凋亡細胞單一或多種成分的識別，可以定量檢測出凋亡細胞的數(shù)量。
5缺血再灌注過程中心肌細胞凋亡的防治
細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的一個重要特征，細胞凋亡的多少決定著缺血再灌注心肌損傷的嚴重程度。有效抑制細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，是促進缺血再灌注后心功能恢復(fù)和減輕心肌致死性損傷的一條重要途徑。
目前，在心肌缺血再灌注過程中防治細胞凋亡發(fā)生的措施包括：消除誘發(fā)細胞凋亡的因素、切斷細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、提高心肌細胞內(nèi)源性保護機制和瓦解細胞凋亡信號。由于心肌缺血再灌注過程中細胞凋亡的發(fā)生是多因素和多途徑的，所以阻斷細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和抑制參與多信號途徑的介質(zhì)是防治細胞凋亡十分有效的方法。
5．1藥理干預(yù)
Cagli等在缺血前10min用咖啡酸苯乙基酯預(yù)處理結(jié)扎左前降支鼠的缺血再灌注模型，缺血30min再灌注120min后檢測DNA末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記的陽性心肌細胞，缺血再灌注、缺血再灌注+咖啡酸苯乙基酯、缺血再灌注+谷胱甘肽組分別為60％、30％、40％，并且缺血再灌注+咖啡酸苯乙基酯組具有明顯減低一氧化氮的生成，增加超氧化物歧化酶的活性，降低血清肌酸激酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的水平。Ono等用TAT-四氫生物蝶呤預(yù)處理鼠心離體再灌注模型后發(fā)現(xiàn)，四氫生物蝶吟組Caspase-3的表達和細胞凋亡數(shù)均明顯下降，TAT-四氫生物蝶呤通過抗細胞凋亡減輕MIRI，可能成為心臟外科心肌保護的一個新的治療因素。
5．2缺血預(yù)適應(yīng)
缺血預(yù)適應(yīng)是近年研究熱點之一，缺血預(yù)處理(ischemicpreconditioning，IPC)具有抑制缺血再灌注心肌細胞凋亡的作用。IPC抑制細胞凋亡的機制與激活PKC和減輕缺血期細胞內(nèi)酸化有關(guān)。此外，IPC還可通過減輕炎癥細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用抑制Bax在缺血區(qū)的表達、減少線粒體CytoC釋放和抑制半朧天冬酶的活性而減少細胞凋亡的發(fā)生。Nakamura等提出，缺血預(yù)適應(yīng)通過抑制中性白細胞積聚和下調(diào)Bax表達而減少心肌細胞凋亡。
5．3熱休克預(yù)處理
石永忠等報道，熱休克預(yù)處理增加熱休克蛋白的表達，并且阻斷線粒體和死亡受體途徑，具有明顯的抗缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡的作用。
5．4基因治療
利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以從各個環(huán)節(jié)對缺血再灌注引起的細胞凋亡進行阻斷，Hua等轉(zhuǎn)染Ad5dnMyD88到鼠心肌3d后，進行缺血45min再灌注4h，并與對照組相比，發(fā)現(xiàn)核因子xB的活性下降50％，Bcl-2水平上升81％，缺血再灌注后的心肌細胞凋亡顯著降低59％。Huang等在大鼠缺血再灌注4d前以腺病毒為載體將Bcl-xL基因轉(zhuǎn)入大鼠心臟，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入Bcl-xL的大鼠缺血再灌注后心肌細胞凋亡較對照組明顯減輕，并減小梗死面積，降低血漿肌酸激酶水平。
5．5中藥對心肌缺血再灌注損傷誘發(fā)細胞凋亡的抑制作用
國內(nèi)大量研究表明，中藥及提取成分具有良好的抑制心肌細胞凋亡的作用，如丹參、川芎嗪、黃芪、葛根素等。有實驗研究，丹參注射液是通過抑制心肌細胞凋亡等作用起到保護心肌缺血再灌注損傷的。李慶林等通過實驗發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷能明顯降低缺血再灌注時的細胞凋亡率。黃芪因具有抗自由基、拮抗鈣超載、改善內(nèi)皮功能等多種作用，目前被應(yīng)用于心肌缺血再灌注損傷并取得顯著療效，但其對再灌注損傷誘發(fā)的細胞凋亡的影響在國內(nèi)未見報道，需進一步實驗研究。
6結(jié)束語
心肌細胞凋亡是正常心肌組織生長的特征之一。但是，發(fā)生在心肌病理狀態(tài)下的心肌細胞凋亡在心臟功能惡化中起到了重要的作用。心肌細胞的凋亡一方面造成了心肌工作細胞數(shù)目的減少，另一方面凋亡后的心肌廣泛纖維化有可能導(dǎo)致心肌重塑和惡性心律失常的發(fā)生。細胞凋亡是通過多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路啟動的細胞自殺過程，是維持機體自身穩(wěn)定的一種重要機制。在心肌缺血再灌注損傷中，細胞凋亡同樣具有這一方面的意義。但是，細胞凋亡過度則可加重心肌組織的破壞，因此，細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷過程中具有一定的病理學(xué)意義。
綜上所述，缺血再灌注組織發(fā)生細胞凋亡的機制是一個多因素的過程。細胞凋亡是缺血再灌注損傷的特征性改變，細胞凋亡的多少決定著缺血再灌注損傷的輕重。現(xiàn)在對心肌缺血再灌注引起細胞凋亡的確切機制尚未闡明，對抗心肌細胞凋亡的治療也大多處于動物試驗階段，特別是基因治療離臨床應(yīng)用還有一段距離?？寡踝杂苫扳}離子拮抗劑的許多試驗結(jié)果并不一致，以致難以真正的應(yīng)用于臨床實踐。這就需要人們更深入地研究啟動再灌注期心肌細胞凋亡程序的各種刺激因素及其介導(dǎo)的細胞分子活動，努力尋求阻斷細胞凋亡信號或其轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的合理方法。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的深入發(fā)展，對細胞凋亡、基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞保護等方面的認識和研究都在逐步提高和深化，對心肌缺血再灌注引起的細胞凋亡的機制和防治正待取得真正的突破。
凋亡是細胞控制生與死的手段。研究凋亡不僅能夠提高對疾病，包括心血管疾病的認識，獲得醫(yī)學(xué)上新的治療方案，而且能夠加深對生命本質(zhì)的理解，具有極其重要的生物學(xué)和哲學(xué)意義。
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