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胡語航王興勇
《兒科藥學(xué)雜志》2007年03期
【作者單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院
缺氧缺血性腎損傷是新生兒窒息、肺炎、休克及腎移植、腎切開取石術(shù)等臨床共同面臨的問題，嚴(yán)重時可發(fā)展為多器官功能障礙綜合癥甚至死亡。核因子B(nuclear factor kappa B，NF-KB)參與多種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中起重要作用。
1 Rel/NF-κB信號傳導(dǎo)通路
1．1 Rel/NF-κB的家族組成及功能
NF-κB是Rel蛋自家族成員，幾乎存在于所有細(xì)胞中，目前在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)易發(fā)現(xiàn)NF-κB Rel家族的五個成員：RelA、NF-κB1、NF-κB2、RelB和C-Rel。每一個家族成員亞基的N末端都有一個約300個氨基酸殘基的Rel同源結(jié)構(gòu)域(RHD)，是介導(dǎo)NF-κB與DNA結(jié)合所必須的，同時還含有核定位序列(NLS)，負(fù)責(zé)活化的NF-κB進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能。典型的NF-κB是由p50和p65亞基組成的異二聚體，幾乎存在于所有真核細(xì)胞中。
NF-κB的抑制蛋白(inhibitor-κB，IκB)家族成員包括IκB-α、β、γ、δ、ε和Bcl-3。IκB具有以下幾種功能：
①阻止NF-κB與DNA結(jié)合；
②通過與NF-κB亞基上的RHD耦聯(lián)，覆蓋NSL，使其不能核易位；
③使NF-κB與DNA形成的復(fù)合體解離，抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。
1．2 NF-κB的活化與調(diào)控
靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白IκB相結(jié)合并以非活化的形式存在于細(xì)胞質(zhì)。IκB抑制蛋白主要是對NF-κB的活化起抑制作用。IκB憑借錨蛋白重復(fù)序列與NF-κB的RHD結(jié)合，掩蔽NF-κB的NLS，使NF-κB滯留于胞漿。
NF-κB激活的機制較為復(fù)雜，目前尚未完全闡明，但可以肯定的是在其信號傳導(dǎo)通路中，IκB激酶(IκK)激活與IκB磷酸化是從NF-κB解離到降解關(guān)鍵的步驟。目前發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)NF-κB活化的信號先使IκB32和36位上的絲氨酸磷酸化，后者在21和22位的賴氨酸位置上迅速泛素化，進(jìn)而觸發(fā)IκB被26S蛋白體快速降解后從NF-κB/IκB復(fù)合體中釋放出來，IκB失活。DiDonat等證實，至少有3種蛋白激酶參與IκB磷酸化及降解，導(dǎo)致NF-κB活化，它們分別是IκB蛋白激酶-1(1κK-1)、IκB蛋白激酶-2(IκK-2)、NF-κB誘導(dǎo)型蛋白激酶(NIK)?；罨腘IK又可使IκK-1和IκK-2磷酸化而被激活。即誘導(dǎo)劑通過激活信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致NIK活化，引起IκK-1、IκK-2磷酸化，IκB從NF-κB/IκB復(fù)合體中解離出來，被胞漿中的蛋白酶降解暴露出核定位位點，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。NF-κB活化的反饋調(diào)節(jié)有兩種途徑：經(jīng)胞外的正反饋途徑和經(jīng)胞內(nèi)外的負(fù)反饋途徑。
2 ICAM-1 mRNA和蛋白的表達(dá)
2．1 ICAM-1轉(zhuǎn)錄及其在腎臟組織中的表達(dá)
細(xì)胞間粘附分子是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互結(jié)合、起粘附作用的膜表面糖蛋白，分ICAM-1、2、3三種。在ICAM-1基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)域有IFN反應(yīng)元件、糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合位點、NF-κB結(jié)合位點、活化劑蛋白-1反應(yīng)元件等。NF-κB、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子可分別與這些元件結(jié)合而影響基因的轉(zhuǎn)錄，即各種刺激因素對這些轉(zhuǎn)錄因子作用從而促進(jìn)ICAM-1基因的轉(zhuǎn)錄。
Muller等用免疫組化的方法研究了15例正常人腎組織中ICAM-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球壁層上皮細(xì)胞可以表達(dá)ICAM-1，ICAM-1強染色也可以見成纖維細(xì)胞、腎小管周圍毛細(xì)血管和大血管的內(nèi)皮細(xì)胞。正常腎小管上皮細(xì)胞也可以低水平表達(dá)ICAM-1，有炎癥反應(yīng)存在時表達(dá)明顯增強。
2．2 NF-κB活化與ICAM-1轉(zhuǎn)錄表達(dá)
ICAM-1含有5個細(xì)胞外的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。ICAM-1表達(dá)的調(diào)控元件位于ICAM-1轉(zhuǎn)錄起始位點上游的115、40和60位點。組織受到缺血缺氧刺激后，IκB降解，NF-κB活化，從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核與靶基因即ICAM-1基因的啟動子和增強子中含有的κB序列相結(jié)合，迅速誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
3缺氧復(fù)氧分子信號機制的三個階段
3．1再灌注的速發(fā)型應(yīng)答
再灌注后數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)，一連串的分子級聯(lián)反應(yīng)很容易被刺激，尤其是那些依賴磷脂酶活化和胞內(nèi)Ca2+的分子。這一階段主要以脂質(zhì)和形成的蛋白為代表，這些蛋白在再灌注血流進(jìn)入循環(huán)一開始就出現(xiàn)并且與內(nèi)皮組織建立聯(lián)系。早已存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面和血小板的粘附因子如P-選擇素也在這一階段表達(dá)增強，粘附分子在細(xì)胞骨架變化及Ca2+釋放后表達(dá)增強。
3．2再灌注的早期反應(yīng)
缺血再灌注后數(shù)分鐘至數(shù)小時內(nèi)，蛋白合成的活化轉(zhuǎn)錄開始，尤其是炎癥因子。在調(diào)節(jié)缺血再灌注分子信號途徑中這些炎癥因子尤其是TNF-α處于中心地位。起初的分子信號從此開始，并傳遞到細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)內(nèi)的激酶被活化，信號至胞核，使轉(zhuǎn)錄因子活化、進(jìn)一步持續(xù)炎癥反應(yīng)。
3．2．1 TNF、NF-κB的活化
TNF是由157個氨基酸殘基組成的同型三聚體。TNF信號途徑已經(jīng)相當(dāng)具有特征性。胞漿內(nèi)TNF與TNF-R1結(jié)合觸發(fā)一連串反應(yīng)，激活核內(nèi)的NF-κB及原癌基因c-jun。這些核因子是誘導(dǎo)炎癥基因轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)。IκB在胞漿內(nèi)磷酸化、泛素化并降解。IκK與TNF-R1共同活化，這一活化過程依賴于RIP。銜接蛋白也參與TNF-R1的活化，從而使得NF-κB、JNK活化。NF-κB、JNK及TNF-R1之間相互作用，使整個信號系統(tǒng)持續(xù)的進(jìn)行，一直到位于核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子的基因開始表達(dá)。
3．2．2 MAPK’s途徑
在所有應(yīng)激誘導(dǎo)的激酶中，p38 MAPK更典型，被認(rèn)為是更重要的炎癥激酶，可以對缺血再灌注后產(chǎn)生的一系列炎癥信號作出應(yīng)答。JNK是分子量約為54KDa的蛋白質(zhì)，在應(yīng)激、TNF、IL-1、LPS及其他一些條件下被活化，它在活化激活蛋白-1(AP-1)、TNF表達(dá)、T細(xì)胞增殖、產(chǎn)生IL-1等過程中有著尤其重要的作用。ERK是與增殖、轉(zhuǎn)化及分化相關(guān)的MAPK，它可以在細(xì)胞外基質(zhì)應(yīng)答中參與產(chǎn)生細(xì)胞因子。MAPK’s途徑中彼此間是一連串相互重疊交錯的信號機制。實驗研究清楚地提示MAPKs在加重缺血再灌注損傷中起重要作用。大多數(shù)情況下，炎癥信號可以被MAPKs強化，而被MAPKs抑制劑下調(diào)。
3．3再灌注的遲發(fā)反應(yīng)
缺血再灌注數(shù)天至數(shù)周后產(chǎn)生分子保護機制，包括細(xì)胞康復(fù)相關(guān)途徑，如抗炎癥細(xì)胞因子(IL-10)，晚發(fā)型粘附分子和生長因子如TGF-β在康復(fù)過程中將會被激活。在細(xì)胞水平，巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞明顯增多，參與修復(fù)過程。
4缺氧-復(fù)氧、PMNs粘附與腎損傷
大量動物試驗表明，多形核白細(xì)胞(PMNs)和其他炎癥細(xì)胞在急性缺血性腎損傷的發(fā)病機制中扮演了重要角色，炎癥細(xì)胞的激活和粘附分子的釋放是組織損傷的關(guān)鍵反應(yīng)。
國內(nèi)學(xué)者已觀察到新生兒窒息后腎損傷組外周血白細(xì)胞計數(shù)明顯高于非損傷組，且與腎功能損傷程度呈正相關(guān)，在窒息大鼠恢復(fù)供氧的模型中進(jìn)一步觀察到腎組織白細(xì)胞滯留數(shù)明顯增多，且與IL-1、IL-8、TNF-α。等炎癥細(xì)胞因子及腎小管損傷程度呈正相關(guān)?？梢奝MNs作為一種致傷因子參與了腎缺血再灌注損傷的發(fā)生。缺血再灌注可激活腎內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，白細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面滾動、粘附和穿越內(nèi)皮移行至炎癥部位是PMNs激活和致炎的重要步驟，其分子基礎(chǔ)是PMNs及血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附分子相互作用及細(xì)胞因子對粘附分子表達(dá)的調(diào)節(jié)。ICAM-1與PMNs上的LFA-1和Mac-1配體相結(jié)合可引起細(xì)胞的粘附滲出，ICAM-1功能的缺陷將引起PMNs粘附和滲出障礙，有利于減輕炎癥反應(yīng)。大量資料表明，CD11/CD18整合素和ICAM-1在缺血再灌注腎損傷的發(fā)病機制中具有重要作用。L-選擇素和P-選擇素可在受炎癥刺激后數(shù)分鐘內(nèi)表達(dá)于細(xì)胞及血小板表面，通過相應(yīng)配體相互作用，介導(dǎo)起始粘附作用及滾動作用。
有學(xué)者認(rèn)為，PMNs在介導(dǎo)缺血再灌注腎損傷起重要作用，其可能機制為：
①PMNs激活后通過“呼吸爆發(fā)”產(chǎn)生活性氧，超過了機體的清除能力，可直接損傷組織和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
②PMNs釋放多種水解蛋白酶等其它可引起組織損傷的酶類，這些物質(zhì)和白三烯、血小板激活因子增加血管通透性，促使炎癥反應(yīng)的粘附分子的表達(dá)。
③PMNs激活后變得僵硬，失去變形能力而不能通過腎毛細(xì)血管，堵塞微循環(huán)，致再灌注后期的無灌流，延長腎缺血時間，加重缺血損傷。
綜上所述，缺氧復(fù)氧、缺血再灌注是一重要的病理現(xiàn)象。缺氧刺激TNF活化，活化NF-κB，致ICAM-1 mRNA表達(dá)增多，ICAM-1介導(dǎo)PMN粘附在腎小管內(nèi)皮細(xì)胞，這三者的時間進(jìn)程關(guān)系提示它們之間存在一定的因果關(guān)系。