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《生命科學(xué)》2011年第10期
朱京譚曉榮
河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院鄭州450001
摘要：
活性氧（reactive oxygen species，ROS）和自噬在人體內(nèi)作用廣泛，且與人類的健康密切相關(guān)。兩者之間關(guān)系復(fù)雜，ROS作為誘導(dǎo)自噬的信號(hào)分子，參與多種誘導(dǎo)自噬的信號(hào)途徑，在自噬的形成過(guò)程中起著重要作用，而自噬具有減少ROS損傷的作用。對(duì)ROS與自噬之間的關(guān)系，包括ROS介導(dǎo)自噬的分子機(jī)制，以及ROS和自噬在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和衰老中的作用進(jìn)行綜述。
活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一類化學(xué)性質(zhì)活潑，具有較高氧化活性的分子或離子的總稱。主要包括超氧陰離子(O2·-)、過(guò)氧化氫(H2O2)、羥自由基(HO·）、一氧化氮（NO·)等。線粒體是ROS的主要產(chǎn)生部位，在線粒體呼吸過(guò)程中會(huì)有少量的電子從線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ中漏出，與O2結(jié)合生成ROS。此外NADPH氧化酶和過(guò)氧化物酶等也能產(chǎn)生ROS。過(guò)量的ROS會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物大分子造成損傷，從而影響其正常生理生化功能。生物體本身存在清除ROS的體系，包括SOD酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、抗壞血酸等，這一體系使生物體內(nèi)ROS保持在對(duì)機(jī)體無(wú)害的水平。
Ashford和Porter在1962年用電子顯微鏡在人肝細(xì)胞中初次觀察到自噬(autophagy)。自噬廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，正常情況下細(xì)胞內(nèi)的自噬處于低水平，在受到外界環(huán)境刺激時(shí)(饑餓、營(yíng)養(yǎng)缺乏、氧脅迫等)自噬水平升高，細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)壽命蛋白、可溶性蛋白、受損細(xì)胞器等胞內(nèi)物質(zhì)會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體進(jìn)行降解，重新利用以滿足細(xì)胞所需，利于細(xì)胞存活。但當(dāng)自噬水平過(guò)高時(shí)，會(huì)因過(guò)度“吞噬”胞內(nèi)物而造成細(xì)胞死亡。
一般情況下，細(xì)胞內(nèi)的ROS和自噬均處于正常水平，并不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成過(guò)度損傷。但在一些不利的狀態(tài)下(如饑餓、營(yíng)養(yǎng)缺乏、藥物刺激、劇烈的環(huán)境變化、細(xì)菌感染以及各種疾病等)，細(xì)胞內(nèi)的ROS和自噬水平都會(huì)顯著升高。ROS與自噬在不利狀態(tài)下的相同反應(yīng)，暗示著兩者可能存在著聯(lián)系。ROS在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要作用，已被人們所肯定。研究表明，在細(xì)胞自噬過(guò)程中ROS同樣有著重要的作用。本文論述ROS與自噬的相互作用關(guān)系及其分子機(jī)制，以及ROS在細(xì)胞自噬過(guò)程中所起作用。
1自噬與ROS的關(guān)系
細(xì)胞自噬過(guò)程常常會(huì)伴隨著ROS含量的變化，能夠誘導(dǎo)自噬的藥物，也能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量的改變。例如脂多糖類(LPSs)和泛半胱天冬酶抑制劑benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(Z-VAD)能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生自噬，并且會(huì)使其ROS含量升高。此外在營(yíng)養(yǎng)缺失以及疾病過(guò)程中產(chǎn)生的自噬同樣伴隨著細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。如果用抗氧化劑降低ROS的含量，自噬水平會(huì)降低。如在癲癇持續(xù)狀態(tài)下的小鼠細(xì)胞內(nèi)，自噬水平升高，產(chǎn)生過(guò)量ROS，施以維生素E，細(xì)胞內(nèi)ROS含量降低，自噬受到部分抑制。這些情況表明ROS與自噬之間存在密切關(guān)系，主要表現(xiàn)在以下兩方面。
1．1自噬降低ROS毒性
正常情況下，生物體內(nèi)的ROS處于較低水平，低水平的ROS在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)以及基因的表達(dá)調(diào)控過(guò)程中起著重要作用，而ROS的過(guò)量累積則會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒性傷害。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)能夠被ROS氧化，喪失正常的功能并累積產(chǎn)生毒性。由于線粒體是ROS的主要來(lái)源，且線粒體DNA比核DNA更加脆弱，因此線粒體更易遭受ROS的攻擊而產(chǎn)生損傷。過(guò)量的ROS還會(huì)使線粒體發(fā)生去極化損傷，導(dǎo)致線粒體自噬。線粒體自噬是一個(gè)特異性的選擇過(guò)程，是細(xì)胞清除受損線粒體，維持自身穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。但線粒體自噬也有可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。自噬作為細(xì)胞在不利環(huán)境下的一種存活機(jī)制，可通過(guò)清除被ROS損傷的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)，降低ROS對(duì)細(xì)胞的毒性傷害，保護(hù)細(xì)胞。但有報(bào)道認(rèn)為，自噬的激活也可加劇ROS的累積。另外在動(dòng)物水平，如果體內(nèi)固有的ROS清除系統(tǒng)發(fā)生異常，致使ROS累積，那么機(jī)體會(huì)補(bǔ)償性地提升自噬水平來(lái)降解ROS。例如，在ROS清除劑超氧化物歧化酶(SOD1)發(fā)生突變的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)受到抑制，而自噬標(biāo)志物Ⅱ型微管相關(guān)蛋白質(zhì)1輕鏈3(LC3-Ⅱ)累積。如果自噬的產(chǎn)生受到抑制，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量的升高。例如，在自噬相關(guān)基因突變的酵母菌細(xì)胞內(nèi)ROS水平會(huì)比野生型的酵母菌株的高。自噬雖然能夠抵抗ROS的毒性，但是如果細(xì)胞內(nèi)的ROS水平超出自噬所能承受的范圍，即通過(guò)自噬仍不能清除過(guò)量的ROS，始終保持在較高水平，則會(huì)引起細(xì)胞過(guò)度自噬，終導(dǎo)致細(xì)胞死亡?？梢钥吹剑咀鳛榧?xì)胞存活機(jī)制存在的自噬，一旦被過(guò)度激發(fā)，反而會(huì)造成細(xì)胞死亡。這提示，生物體內(nèi)的生化反應(yīng)異常復(fù)雜和準(zhǔn)確，在探索和研究中一定要謹(jǐn)慎。
1．2 ROS介導(dǎo)自噬發(fā)生
ROS可誘導(dǎo)自噬并在自噬過(guò)程中起重要作用，多種情況能夠引起細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，進(jìn)而檢測(cè)到自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ的累積。一些外源物質(zhì)通過(guò)刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬。例如檳榔提取物和線粒體電子傳遞鏈抑制劑等能夠引起癌細(xì)胞中ROS水平升高，誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生；苯并惡嗪衍生物DBO通過(guò)促使胞內(nèi)ROS水平升高誘導(dǎo)自噬；直接添加H2O2也會(huì)誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生。另外在一些疾病中，內(nèi)源性的ROS水平也會(huì)升高，引起自噬，如在壞死性小腸結(jié)腸炎疾病中，腫瘤壞死因子TNF-α可以顯著的造成線粒體功能異常，進(jìn)而產(chǎn)生大量ROS，誘導(dǎo)線粒體自噬的產(chǎn)生。在一些神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病(AD)中，ROS在自噬的誘導(dǎo)過(guò)程中也起著重要作用，而腫瘤細(xì)胞中ROS也能誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生。
2 ROS影響自噬的機(jī)制
通過(guò)前文的論述，可知ROS能夠誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，作為介導(dǎo)自噬的信號(hào)分子，其作用機(jī)制目前仍未清楚，還需要深入研究。下面列舉了一些已經(jīng)報(bào)道的相關(guān)分子機(jī)制，從中可以看到其機(jī)制的復(fù)雜（圖1)。
ROS自身可通過(guò)Beclin-1、HMGB1、p38/p53、GSK-3β、Ca來(lái)誘導(dǎo)自噬；
也可通過(guò)抑制Atg4、Akt/mTOR進(jìn)而誘導(dǎo)自噬；
TIGAR間接降低ROS水平，阻礙自噬產(chǎn)生。
圖中用虛線標(biāo)注的Ca途徑為推測(cè)的可能途徑。
(ROS：活性氧；autophagy：自噬；HMGB1：染色質(zhì)相關(guān)的核蛋白
TIGAR：一種p53靶基因編碼的蛋白TP-53誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡調(diào)控因子；)
圖1 ROS影響自噬的途徑
酵母自噬發(fā)生過(guò)程中，Atg4對(duì)Atg8(LC3、GATE-16的同源物)的C端進(jìn)行剪切，被剪切后的Atg8與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，然后Atg8-PE結(jié)合到自噬小體膜上，參與自噬小體的裝配，促進(jìn)自噬小體的成熟。當(dāng)自噬小體與溶酶體融合后，Atg4剪切Atg8-PE釋放出Atg8。RuthScherz-Shouval等報(bào)道，饑餓促使細(xì)胞產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)自噬，在此過(guò)程中H2O2與HsAtg4A(屬Atg4家族)作用上調(diào)自噬水平。HsAtg4A是半胱氨酸蛋白酶，在其活性位點(diǎn)下游4個(gè)氨基酸處有一半胱氨酸殘基Cys，用絲氨酸替代Cys81后，其氧化還原敏感性降低，以GATE-16為標(biāo)記的自噬小體的形成受到顯著抑制。H2O2可能作用于Cys81使得HsAtg4A部分失活，喪失剪切Atg8-PE的能力，以至于Atg8-PE在細(xì)胞內(nèi)積累，促進(jìn)自噬的產(chǎn)生。
Beclin-1(Atg6的同源物)是與人體細(xì)胞自噬形成相關(guān)的一種重要蛋白，Beclin-1和Beclin-2相互作用調(diào)控自噬水平，上調(diào)Beclin-1的表達(dá)量能夠促進(jìn)自噬的產(chǎn)生。有研究表明Beclin-1的表達(dá)量與ROS相關(guān)，例如在癌細(xì)胞中氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins)通過(guò)過(guò)氧化物酶體增生物激活受體(PPARγ)激活脯氨酸氧化酶，形成過(guò)氧化物上調(diào)Beclin-1，終引起自噬。在此過(guò)程中Beclin1的上調(diào)需要脯氨酸氧化酶產(chǎn)生的ROS；另一種新的自噬調(diào)控因子，染色質(zhì)相關(guān)的核蛋白HMGB1在饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬中有重要作用，ROS和Beclin-1參與HMGB1對(duì)自噬的調(diào)控。在饑餓狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)ROS含量增多，通過(guò)與ROS相關(guān)的信號(hào)途徑可以促使細(xì)胞核內(nèi)的HMGB1向胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞質(zhì)中HMGB1取代Beclin-2直接與Beclin-1相互作用，進(jìn)而上調(diào)自噬水平。
mTOR和classⅢPI3K對(duì)自噬有調(diào)控作用，ROS可通過(guò)它們對(duì)自噬產(chǎn)生影響。例如，在U251型人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，H2O2通過(guò)激活classⅢPI3K/Beclin1信號(hào)通路，抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中的Akt和mTOR的活性，誘導(dǎo)自噬，對(duì)自噬有調(diào)節(jié)功能的Beclin-2也參與其中。
促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)也與自噬形成相關(guān)。水飛薊素(silibinin)可以誘導(dǎo)HT1080型人纖維肉瘤細(xì)胞發(fā)生自噬型細(xì)胞死亡，這一過(guò)程受ROS-p38的介導(dǎo)，p38是MAPK蛋白家族成員，ROS-p38信號(hào)途徑激活p53引起自噬型細(xì)胞死亡。
此外在MES-13型腎小球系膜細(xì)胞中，鎘(cadmium，Cd）誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，這一過(guò)程受3β糖原合成酶激酶(GSK-3β)信號(hào)途徑調(diào)節(jié)。ROS還能與一些離子通道蛋白互作，影響一些離子(Ca2+、K+等)的正常轉(zhuǎn)運(yùn)，而Hoyer-Hansen等認(rèn)為Ca2+含量的增加能有效誘導(dǎo)自噬，說(shuō)明ROS可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量而誘導(dǎo)自噬。
一種p53靶基因編碼的蛋白TP-53誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡調(diào)控因子(TIGAR)能夠間接的降低ROS水平，阻礙自噬產(chǎn)生。抑制TIGAR的表達(dá)，則能促進(jìn)ROS依賴型自噬的產(chǎn)生。
ROS的作用是廣泛的，其誘導(dǎo)自噬的信號(hào)通路不止一條。ROS信號(hào)可能通過(guò)某一條或者多條信號(hào)通路引起自噬，分子機(jī)制非常復(fù)雜。另外，究竟通過(guò)哪條信號(hào)途徑誘導(dǎo)自噬還受到多種因素的影響，如細(xì)胞型、受刺激類型、實(shí)驗(yàn)環(huán)境等。另外，在自噬的調(diào)控過(guò)程中究竟哪一種ROS起作用，也值得去探究。一些研究者認(rèn)為H2O2是調(diào)控自噬的主要ROS，但Chen等認(rèn)為超氧陰離子是調(diào)控自噬的主要ROS。
3 ROS介導(dǎo)的自噬與疾病
隨著對(duì)自噬研究的不斷深入，越來(lái)越多的研究表明自噬與多種疾病有關(guān)聯(lián)，而在一些疾病中也檢測(cè)到較高水平的ROS。在腫瘤、神經(jīng)退行性等疾病中，ROS誘導(dǎo)的自噬對(duì)疾病的產(chǎn)生和發(fā)展有著重要作用。
3．1腫瘤
腫瘤細(xì)胞普遍處于缺氧狀態(tài)，缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)在細(xì)胞對(duì)缺氧的應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。在氧含量正常的情況下蛋白酶體降解HIF-1，抑制其活性，但在腫瘤細(xì)胞中線粒體產(chǎn)生的ROS可以使HIF-1穩(wěn)定的存在。HIF-1能夠活化BNIP-3(Bcl-2/E1B-19K-interactingprotein3)和NIX(BNIP3類似物)，活化的BNIP-3和NIX與Beclin-2結(jié)合，釋放Beclin-1誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，自噬可以減少ROS的生成和線粒體的聚集，有利于腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下存活，對(duì)腫瘤有促進(jìn)作用；饑餓或者雷帕霉素處理的HeLa細(xì)胞自噬過(guò)程中活化的NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS能夠激活JAk2/STAT3(Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3)途徑，自噬過(guò)程通過(guò)活化JAk2/STAT3和隨后分泌的生長(zhǎng)因子促進(jìn)癌細(xì)胞存活。另外Red-Br-nos(微管蛋白結(jié)合物諾斯卡品的類似物)能夠誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞PC-3產(chǎn)生自噬，并釋放ROS，清除ROS會(huì)降低自噬水平。在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中，HYD1(一種D-氨基酸肽)誘導(dǎo)的自噬有助于癌細(xì)胞的存活，ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸能夠抑制HYD1誘導(dǎo)的自噬，這些均表明ROS在癌細(xì)胞自噬的產(chǎn)生過(guò)程中起重要作用。而且在一些癌細(xì)胞中，自噬作為細(xì)胞凋亡的抵抗機(jī)制，也有促進(jìn)癌細(xì)胞存活的作用。例如，冬凌草素甲能誘導(dǎo)鼠科纖維肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生ROS、自噬和凋亡，抑制自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而促進(jìn)自噬能促進(jìn)癌細(xì)胞存活。
另?yè)?jù)Gao等報(bào)道，有抗癌作用的塞來(lái)昔布(celecoxib)衍生物OSU-03012誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生自噬型細(xì)胞死亡，且ROS的積累與自噬的產(chǎn)生相關(guān)。表明自噬具有抗癌作用，這與其促進(jìn)癌細(xì)胞存活的作用相反。
綜上所述，自噬對(duì)癌細(xì)胞有雙重作用，但都與ROS有關(guān)，究竟是促進(jìn)還是抑制腫瘤，存在諸多爭(zhēng)議。但應(yīng)當(dāng)看到，適度的自噬對(duì)癌細(xì)胞的存活是有利的，一旦自噬水平超過(guò)一定閾值，則會(huì)造成癌細(xì)胞的死亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)，而ROS能夠影響自噬水平，因此推測(cè)ROS也是決定癌細(xì)胞存活的因素。
3．2神經(jīng)退行性疾病
自噬能夠清除并降解在帕金森病(PD)和阿爾茨海默病中產(chǎn)生的有害蛋白質(zhì)。許多情況下，在神經(jīng)退行性疾病中能夠觀測(cè)到氧化應(yīng)激增強(qiáng)及ROS的生成，造成自噬水平的升高。例如在多巴胺D(2)受體敲除的PD小鼠模型中，氧脅迫(oxidative stress)的增強(qiáng)和聚合α-共核蛋白的形成(α-synuclein)與升高的自噬水平相關(guān)。Alessandro等發(fā)現(xiàn)，PD患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中經(jīng)硝基酪氨酸（NT)修飾的α-共核蛋白的聚集性增強(qiáng)，其含量與細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度相關(guān)，而且PBMC中自噬水平顯著升高。
β-淀粉樣蛋白是AD的主要致病因子，并能誘導(dǎo)自噬，此過(guò)程受ROS介導(dǎo)。自噬導(dǎo)致溶酶體中β-淀粉樣蛋白的累積，造成溶酶體膜通透性增加，終可能引起細(xì)胞凋亡。
4衰老
衰老是一種重要的生理現(xiàn)象，細(xì)胞和組織中的不利變化隨時(shí)間流逝而不斷積累引發(fā)衰老，其自噬功能會(huì)不斷減弱，終會(huì)導(dǎo)致死亡。在一些長(zhǎng)壽命細(xì)胞內(nèi)，如心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞，脂褐質(zhì)會(huì)隨時(shí)間不斷產(chǎn)生并沉積下來(lái)，阻礙線粒體的自噬，致使衰老的線粒體累積，產(chǎn)生更多的ROS，氧化應(yīng)激的不斷增強(qiáng)，反過(guò)來(lái)繼續(xù)損傷線粒體和溶酶體，激發(fā)促凋亡途徑，終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，清除損傷線粒體的自噬，即線粒體自噬有抗衰老的作用。此外，在衰老的酵母細(xì)胞內(nèi)，人類精液中的亞精胺組分能可通過(guò)抑制組蛋白?；D(zhuǎn)移酶（HAT)活性而觸發(fā)組蛋白H3的漸進(jìn)性脫乙?；饔?，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激。這種染色質(zhì)乙?；癄顟B(tài)的變化能上調(diào)多種自噬相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物，促進(jìn)自噬水平升高，從而延長(zhǎng)壽命。
5討論
綜上所述，ROS誘導(dǎo)的自噬在一定范圍內(nèi)對(duì)機(jī)體有積極作用，但過(guò)量的ROS會(huì)誘導(dǎo)自噬型細(xì)胞死亡，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響。盡管許多ROS介導(dǎo)的自噬產(chǎn)生途徑被發(fā)現(xiàn)，但是對(duì)完整的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑仍缺乏清晰的認(rèn)識(shí)，需要不斷深入研究，以完善相關(guān)信號(hào)通路。另外存在多種ROS，它們是單獨(dú)的調(diào)控自噬，還是一起作用于自噬，存在爭(zhēng)論!需要找到或開發(fā)出更為準(zhǔn)確的探測(cè)和標(biāo)記各種ROS的方法，以便更為準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)它們各自在自噬中的具體作用?？梢钥吹剑琑OS和自噬在細(xì)胞內(nèi)的作用非常廣泛，信號(hào)通路異常復(fù)雜，而且與人類健康密不可分，但將現(xiàn)有的并不完整的理論應(yīng)用到臨床治療上是非常危險(xiǎn)的，在這方面應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎對(duì)待。