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劉壘馮杜朱玉山陳佺
《中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報》2012年10期
【作者單位】：中國科學(xué)院動物研究所；南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院
【摘要】：
線粒體自噬(mitophagy)是指細(xì)胞通過自噬的機(jī)制選擇性地清除線粒體的過程。選擇性清除受損傷或功能不完整的線粒體對于整個線粒體網(wǎng)絡(luò)的功能完整性和細(xì)胞生存來說十分關(guān)鍵。線粒體自噬的異常和很多疾病密切相關(guān)，因此對于線粒體自噬的具體分子機(jī)制以及生理意義研究有很重要的生物學(xué)意義。線粒體自噬的研究是目前生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，該文主要綜述了近年來在線粒體自噬領(lǐng)域取得的研究進(jìn)展，旨在為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供參考。
1線粒體自噬的概述
線粒體決定細(xì)胞的生存和死亡。一方面，線粒體是細(xì)胞的能量工廠，通過氧化磷酸化為細(xì)胞的生存提供能量和生物合成的底物；另一方面，線粒體代謝過程中活性氧的異常積累會引起線粒體損傷，從而釋放促凋亡蛋白，如細(xì)胞色素C和其它凋亡因子等。細(xì)胞色素C釋放能引起凋亡蛋白復(fù)合體(apoptosome)的形成和Caspase-9的激活，并通過一系列級聯(lián)放大反應(yīng)來活化下游的Caspase家族蛋白，啟動細(xì)胞的凋亡過程。
為維持細(xì)胞的正?；顒訝顟B(tài)，受損傷或不需要的線粒體需被及時清除掉。新的研究表明，細(xì)胞主要通過自噬機(jī)制選擇性地清除受損傷或不需要的線粒體，這一過程被稱為線粒體自噬(mitochondrial autophagy或mitophagy)。早在1962年就有文獻(xiàn)報道，體外灌注的大鼠肝臟用胰高血糖素處理15min后，通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)了很多被膜結(jié)構(gòu)包裹的線粒體，并且這些線粒體隨后會被溶酶體降解掉。但線粒體自噬這一概念由Lemasters于2005年正式提出。他觀察到線粒體膜電位降低和線粒體通透性膜孔開放能引起線粒體自噬，并認(rèn)為線粒體自噬可能在減少由衰老引起的線粒體DNA突變中起著重要的作用。越來越多的研究表明線粒體的清除是一個選擇性的過程，線粒體自噬的研究是目前細(xì)胞生物學(xué)和線粒體研究領(lǐng)域的熱點課題。線粒體自噬的異常與多種疾病包括神經(jīng)退行性疾病、血液病和心血管疾病甚至癌癥的發(fā)生有密切關(guān)系。研究線粒體自噬的分子調(diào)控機(jī)制將有助于了解這些疾病的發(fā)生機(jī)制和尋找新的疾病預(yù)防及治療的策略。
2線粒體選擇性自噬的機(jī)制
2．1酵母中線粒體自噬的調(diào)控機(jī)制
自噬主要的生理功能是能夠?qū)|(zhì)中的大分子物質(zhì)和一些損壞的細(xì)胞器通過溶酶體途徑降解，實現(xiàn)能量的再循環(huán)，以維持細(xì)胞自身的穩(wěn)定。自噬分為三種類型，分別是大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperonemediated autophagy，CMA)。目前研究尤其充分的是大自噬，大自噬是指長壽命蛋白或細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹起來，并且和溶酶體發(fā)生融合并降解的過程。自噬的早期研究主要是利用酵母開展的，前期的研究工作鑒定出了一系列參與自噬過程的蛋白質(zhì)，這些蛋白都被命名為Atg(autophagy-related gene)家族蛋白。目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了36種Atg家族蛋白，這些蛋白在自噬的不同階段發(fā)揮著重要的作用。其中Atg6通過和VPS34形成復(fù)合物參與了自噬的起始階段。自噬體的延伸需要兩個蛋白結(jié)合系統(tǒng)，這兩個系統(tǒng)各含有一個泛素類似的蛋白Atg12或Atg8。Atg12能夠和Atg5及Atg16形成一個大的復(fù)合物，而Atg8能夠在Atg4、Atg3和Atg7的幫助下和一個膜脂成分磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，兩者都參與了自噬小泡的延伸。在饑餓的情況下，酵母也會發(fā)生典型的線粒體自噬。酵母中可以很方便地進(jìn)行大規(guī)模的篩選實驗，因此，酵母線粒體自噬的調(diào)控機(jī)制研究取得了很多進(jìn)展。Uth1p是很早發(fā)現(xiàn)的調(diào)控酵母線粒體自噬的一個蛋白，它是一個線粒體外膜蛋白，Uth1p基因的缺失能夠抑制由饑餓或者雷帕霉素引起的酵母線粒體蛋白的降解，提示這個蛋白在線粒體選擇性清除中起著關(guān)鍵的作用。隨后又發(fā)現(xiàn)另一個位于線粒體膜間隙的蛋白Aup1p也參與了酵母的線粒體自噬，Aup1p是一種磷酸酶，它參與了酵母細(xì)胞生長平臺期發(fā)生的線粒體自噬的調(diào)控。
近期Klionsky和Ohsumi實驗室同時鑒定出了一個參與酵母線粒體自噬調(diào)控的新蛋白，這個蛋白被命名為Atg32。Atg32是一個線粒體外膜蛋白，其N末端定位于胞漿，C末端位于線粒體膜間隙。在非發(fā)酵的甘油培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，當(dāng)酵母進(jìn)入對數(shù)生長后期后，就會發(fā)生線粒體自噬從而降解掉一部分線粒體，而Atg32缺失的酵母能夠幾乎完全抑制這種線粒體自噬的產(chǎn)生。Atg32的缺失并不會影響?zhàn)囸I引起的自噬水平，只是特異地參與了線粒體自噬的調(diào)控。在線粒體自噬被誘導(dǎo)后，Atg32能夠和參與細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白Atg11相互作用。在Atg32的胞漿區(qū)域還具有典型的Atg8結(jié)合區(qū)域即LC3相互作用區(qū)域(LC3 interacting region，LIR)，通過實驗證實Atg32和Atg8有直接的相互作用，Atg32可能通過和隔離膜(isolation membrane)上的Atg8及Atg11的相互作用，使得線粒體逐漸被自噬小泡包裹從而被降解掉，并且Atg32和Atg11的相互作用受到了Atg32的114位絲氨酸磷酸化的調(diào)節(jié)，蛋白激酶Hog1和Pbs2通過調(diào)控未知的蛋白激酶對Atg32的磷酸化能夠促進(jìn)Atg32和Atg11的相互作用和線粒體自噬的發(fā)生。
Atg32在哺乳動物里沒有同源蛋白，這說明哺乳動物里還有其他的基因參與了線粒體自噬的調(diào)控，下面將主要介紹參與哺乳動物線粒體自噬調(diào)控的蛋白。
2．2 Parkin依賴的線粒體自噬的調(diào)控
線粒體膜電位的降低可能導(dǎo)致線粒體自噬。體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞在饑餓的情況下能觀察到快速的線粒體被降解的情況，而用線粒體MPT孔的抑制劑CsA能夠在抑制膜電位降低的同時抑制線粒體自噬的發(fā)生。近期的研究表明，Parkin和Pink1蛋白參與了膜電位降低引起的線粒體自噬的發(fā)生。
Parkin是一個E3泛素連接酶，Pink1是一個絲氨酸/蘇氨酸激酶，位于Parkin的上游發(fā)揮作用。Pink1能磷酸化Parkin，促進(jìn)Parkin由胞漿到線粒體的轉(zhuǎn)位，Parkin和Pink1功能喪失的點突變和帕金森綜合征的發(fā)生有密切的關(guān)系。
美國Richard Youle實驗室研究發(fā)現(xiàn)，Parkin能被選擇性地募集到膜電位降低的線粒體，并且介導(dǎo)線粒體被自噬體包裹。Pink1和Parkin有相互作用，Pink1在損傷的線粒體上的積累能為Parkin選擇性降解線粒體提供信號(圖1)。Parkin被募集到線粒體上后能通過介導(dǎo)VDAC1的泛素化參與線粒體的自噬，在這個過程中p62也被募集到線粒體上，啟動了線粒體自噬。但也有文章表明，p62只參與了Parkin介導(dǎo)的線粒體聚集而與線粒體自噬沒有關(guān)系，而VDAC1在線粒體自噬中的作用尚有爭論。Parkin和Pink1還能通過協(xié)同降解Miro蛋白影響線粒體運(yùn)動，從而在損傷的線粒體被降解之前先阻滯了其運(yùn)動，而在損傷的線粒體上Pink1和TOM復(fù)合體形成一個700kDa左右的復(fù)合物，參與了Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的調(diào)控。同時果蠅里的研究表明，Parkin和Pink1能介導(dǎo)和線粒體融合有關(guān)的蛋白Mfn的泛素化，Parkin或Pink1缺失的情況下，Mfn的蛋白量增加，從而促進(jìn)了線粒體的融合，而Mfn的泛素化也可能是線粒體自噬的信號，泛素化的Mfn被清除后，線粒體的融合功能喪失，隨后會通過自噬被降解掉。而在哺乳動物中的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體分裂有關(guān)的蛋白Drp1是Parkin的底物，敲減Parkin后會引起線粒體的破碎。關(guān)于Pink1在線粒體自噬中的作用，也有相反的報道，在SH-SY5Y細(xì)胞里面敲減Pink1后能引起線粒體的片段化，而高表達(dá)Pink1能增加線粒體的融合程度并抑制藥物引起的線粒體自噬。所以，關(guān)于Parkin和Pink1在線粒體動態(tài)變化以及損傷的線粒體被選擇性清除的過程中所扮演的角色和具體機(jī)制仍有待更深入的研究。
2．3缺氧介導(dǎo)的線粒體自噬的調(diào)控
我們新的研究表明，線粒體外膜蛋白FUNDC1參與了缺氧介導(dǎo)的線粒體自噬。FUNDC1是一個三次跨膜蛋白，定位在線粒體外膜上，在FUNDC1高表達(dá)的情況下能夠引起明顯的線粒體自噬，并且FUNDC1引起的線粒體自噬是Atg5依賴的。FUNDC1存在保守的LIR結(jié)構(gòu)域，并且依賴LIR和自噬的關(guān)鍵分子LC3相互作用，來介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的線粒體自噬。LIR保守結(jié)構(gòu)域的突變或缺失能夠抑制其與LC3的相互作用和線粒體自噬。FUNDC1高表達(dá)引起的線粒體自噬在Atg5敲減的細(xì)胞里受到了明顯的抑制，而Beclin1的敲減并不能抑制FUNDC1引起的線粒體自噬，提示FUNDC1引起的線粒體自噬和文獻(xiàn)報道的神經(jīng)毒性藥物MPP(+)引起的線粒體自噬一樣，都是Beclin1非依賴的。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，F(xiàn)UNDC1的磷酸化在線粒體自噬調(diào)控中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在正常情況下，F(xiàn)UNDC1能被蛋白激酶Src磷酸化，而磷酸化的FUNDC1和LC3的相互作用比較弱，F(xiàn)UNDC1的功能受到抑制。在低氧情況下，蛋白激酶Src的活性降低，導(dǎo)致FUNDC1磷酸化水平的降低，從而促進(jìn)其與LC3相互作用和線粒體自噬的發(fā)生。
像Atg32一樣，F(xiàn)UNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬也受到磷酸化調(diào)控，這進(jìn)一步說明了線粒體自噬機(jī)制在進(jìn)化上的保守性(圖2)。FUNDC1作為新的線粒體自噬受體的發(fā)現(xiàn)使我們有機(jī)會進(jìn)一步研究哺乳動物細(xì)胞線粒體自噬的調(diào)控機(jī)制。有必要進(jìn)一步分析FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬與Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的相互關(guān)系及FUNDC1的生理功能及其與疾病發(fā)生的關(guān)系。
2．4 Bnip3/Nix介導(dǎo)的線粒體自噬
Bnip3蛋白及其同源蛋白Bnip1和Bnip2起初是利用腺病毒的E1B 19kDa蛋白做誘餌通過酵母雙雜交鑒定出來的，這些蛋白能和E1B 19kDa蛋白以及Bcl2蛋白相互作用。隨后一系列的文章證明了Bnip3具有誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用。Bnip3能形成穩(wěn)定的二聚體，并且C端的跨膜區(qū)對于其在線粒體的定位是必需的，高表達(dá)Bnip3能誘導(dǎo)大鼠的成纖維細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的凋亡，而Bn中3跨膜區(qū)缺失的突變體不能誘導(dǎo)凋亡。Bn中3除了在細(xì)胞死亡中發(fā)揮著重要的作用，同時它也是細(xì)胞自噬乃至線粒體自噬過程中的重要參與者。膠質(zhì)瘤用Ceramide或Arsenictrioxide處理后會出現(xiàn)典型的自噬性細(xì)胞死亡，Bnip3在這種情況下的表達(dá)量有明顯的升高，而且腫瘤細(xì)胞直接轉(zhuǎn)染Bnip3能出現(xiàn)很明顯的自噬現(xiàn)象。在缺血再灌注模型中，Bnip3功能缺失的突變體能夠起到保護(hù)作用，而用Atg5 K130R抑制自噬會使細(xì)胞死亡增加。所以，Bnip3在缺血再灌注損傷的情況下會激活自噬反應(yīng)，后者清除損傷的線粒體，可能會起到一種保護(hù)作用。近期的研究表明，Bnip3和自噬的關(guān)鍵蛋白LC3有直接的相互作用，介導(dǎo)了線粒體自噬的發(fā)生。
紅細(xì)胞成熟的過程中需要有線粒體等細(xì)胞器的選擇性清除，因此紅細(xì)胞的成熟過程為線粒體自噬提供了一個很好的研究模型。Nix和Bnip3在蛋白序列上有56％的同源性，并且在人的各個組織里廣泛表達(dá)，而且在腫瘤細(xì)胞里高表達(dá)Nix能明顯抑制細(xì)胞的增殖。Nix的表達(dá)量在紅細(xì)胞分化成熟中顯著上調(diào)，這可能和Nix在紅細(xì)胞成熟過程線粒體通過自噬被清除的過程中扮演著重要的角色有關(guān)系。Nix敲除的小鼠存在成熟紅細(xì)胞的減少和幼稚粒細(xì)胞的增加，而且這種小鼠紅細(xì)胞里面的線粒體仍然存在，說明在Nix缺失的情況下紅細(xì)胞成熟過程中線粒體的清除發(fā)生了障礙。Nix被誘導(dǎo)后通過某些未知的原因引起線粒體膜電位下降，從而激活自噬機(jī)制，引起線粒體被選擇性地清除。進(jìn)一步的研究表明，Nix可能是一個線粒體自噬的直接受體，它能夠和LC3蛋白直接結(jié)合，并募集LC3到損傷的線粒體上引起線粒體自噬的發(fā)生。
Ulk1是酵母Atg1基因在哺乳動物中的同源蛋白。新的研究表明，Ulk1作為一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在紅細(xì)胞成熟過程中對線粒體的選擇性清除發(fā)揮著重要的作用。在Ulk1基因敲除的小鼠血液里未成熟的網(wǎng)織紅細(xì)胞明顯增加，并且出現(xiàn)一種和網(wǎng)織紅細(xì)胞一樣有線粒體存在的CD71陰性的紅細(xì)胞，而且在體外培養(yǎng)的條件下，Ulk1基因缺失的網(wǎng)織紅細(xì)胞的線粒體的清除有所減緩。但是，Ulk1的缺失并不能抑制饑餓引起的自噬的發(fā)生，表明Ulk1參與了紅細(xì)胞成熟過程中線粒體選擇性清除的過程。
另外一個自噬的關(guān)鍵蛋白Atg7也參與了紅細(xì)胞發(fā)育過程中的線粒體自噬，在血液系統(tǒng)中特異地敲除和自噬有關(guān)的基因Atg7后，小鼠紅細(xì)胞中線粒體的清除發(fā)生障礙，導(dǎo)致很多損傷的線粒體的堆積，引起紅細(xì)胞死亡從而導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的貧血。
2．5線粒體融合分裂及相關(guān)蛋白和線粒體自噬的關(guān)系
一些研究也發(fā)現(xiàn)，和線粒體融合與分裂有關(guān)的蛋白質(zhì)也參與到了線粒體自噬過程中。線粒體分裂后通常會產(chǎn)生兩個不均勻的子代。其中部分線粒體能恢復(fù)膜電位，并能與其他線粒體發(fā)生融合，成為線粒體網(wǎng)絡(luò)的一部分。有些線粒體膜電位不能恢復(fù)，膜電位下降的線粒體就會被選擇性地通過自噬降解。高表達(dá)促進(jìn)線粒體融合的蛋白OPA1能抑制線粒體自噬的發(fā)生?？磥砭€粒體融合不僅能拮抗線粒體分裂，也能阻止線粒體自噬。這三者間存在一種動態(tài)平衡來調(diào)控線粒體質(zhì)量。
Fis1也是一個和線粒體分裂有關(guān)的蛋白，它能與線粒體分裂有關(guān)的蛋白Drpl相互作用來促進(jìn)線粒體的分裂。有研究表明，F(xiàn)is1也可能參與了線粒體自噬的調(diào)節(jié)，高表達(dá)Fis1以及它的一個突變體都能夠促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生。
總之，在哺乳動物細(xì)胞里面有很多蛋白參與了線粒體的自噬，既有自噬過程中的關(guān)鍵分子如Ulk1和Atg7，也有與線粒體形態(tài)變化有關(guān)的蛋白Fis1和Parkin。與細(xì)胞死亡有關(guān)的蛋白Bnip3和Nix，以及參與了缺氧介導(dǎo)的線粒體自噬的FUNDC1都定位在線粒體上并且和自噬中的關(guān)鍵蛋白LC3有直接的相互作用，是介導(dǎo)線粒體自噬的關(guān)鍵受體蛋白(圖3)。這些蛋白一起協(xié)同參與了線粒體自噬的發(fā)生，并且這些蛋白可能在線粒體自噬的不同階段發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。
3線粒體自噬的生理意義
3．1線粒體自噬的重要性
線粒體主要通過電子傳遞鏈產(chǎn)生ATP為機(jī)體提供生存所需的能量，但是在電子傳遞的過程中也有副產(chǎn)物活性氧(ROS)的出現(xiàn)，ROS包括過氧化物、羥自由基以及過氧化氫。ROS能攻擊蛋白質(zhì)、脂肪酸和核酸并且啟動過氧化的連鎖反應(yīng)。因此，損傷的線粒體需要被及時地清除掉，否則其可能會對細(xì)胞造成更嚴(yán)重的危害。選擇性的線粒體自噬在線粒體的清除中發(fā)揮著重要的作用。MPT孔的開放能夠促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生，MPT孔的抑制劑CsA能夠阻止MPT線粒體的去極化，并且能抑制線粒體自噬的發(fā)生，在這種情況下?lián)p傷的線粒體能通過線粒體自噬被清除掉。
3．2線粒體自噬和衰老
線粒體自噬和細(xì)胞的衰老也有關(guān)系。線粒體是一個持續(xù)的ROS的來源地，這些ROS導(dǎo)致mtDNA的突變，線粒體DNA的修復(fù)能力不強(qiáng)，使得這些突變逐漸積累。線粒體DNA的突變可能削弱氧化磷酸化關(guān)鍵的蛋白的合成，會導(dǎo)致產(chǎn)能衰竭和細(xì)胞死亡。因此，通過線粒體自噬清除功能喪失的線粒體能夠抑制細(xì)胞的衰老。隨著機(jī)體的衰老，細(xì)胞的自噬機(jī)制也逐漸減弱，使損傷的線粒體逐漸堆積，會加劇衰老。
3．3線粒體自噬和紅細(xì)胞及淋巴細(xì)胞發(fā)育
近期一系列的研究發(fā)現(xiàn)，幾個與自噬有關(guān)的基因(Atg7、Ulk1)以及與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因(Nix)參與了紅細(xì)胞成熟過程中線粒體的選擇性清除過程。在這些基因敲除的小鼠中都存在紅細(xì)胞成熟障礙，紅細(xì)胞中線粒體的清除受到了影響，從而使得紅細(xì)胞的功能也受到了抑制，導(dǎo)致了貧血或者其他的一些血液系統(tǒng)疾病。同樣，線粒體自噬在T淋巴細(xì)胞的發(fā)育成熟過程中也起著重要的作用。在Atg7敲除的小鼠中，T淋巴細(xì)胞的線粒體清除發(fā)生障礙，從而使得細(xì)胞里的活性氧的產(chǎn)生增加，并且導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的功能障礙以及凋亡。
3．4線粒體自噬和神經(jīng)系統(tǒng)疾病
線粒體自噬對于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能的維持也是很重要的。神經(jīng)細(xì)胞依賴于自噬來控制蛋白的質(zhì)量并且移除損傷的線粒體。在正常的情況下，線粒體自噬能起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，然而有時線粒體自噬的調(diào)節(jié)失常會導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病。線粒體功能的喪失可能在帕金森癥的發(fā)生中起著重要的作用，而Parkin對于維持線粒體的正常功能是很關(guān)鍵的。Parkin能夠選擇性地被募集到膜電位下降的線粒體上，從而介導(dǎo)線粒體的自噬，清除掉功能喪失的線粒體。而在帕金森癥中經(jīng)常存在著Parkin蛋白的突變而導(dǎo)致的功能喪失，Parkin的功能喪失會引起線粒體自噬的缺陷，從而導(dǎo)致帕金森癥的發(fā)生。
在一種Purkinje細(xì)胞降解(Purkinje cell degeneration，PCD)小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體的過度自噬還和Purkinje細(xì)胞的逐漸消失有著密切的關(guān)系。這種小鼠有顯著的神經(jīng)共濟(jì)失調(diào)，這種共濟(jì)失調(diào)主要是由于99％的Purkinje細(xì)胞在小鼠出生后3周內(nèi)就消失而造成的。這種小鼠的Purkinje細(xì)胞自噬明顯被上調(diào)，從而選擇性地降解線粒體，因為線粒體被過度地降解，使得Purkinje細(xì)胞發(fā)生能量崩潰，導(dǎo)致Purkinje細(xì)胞的死亡。然而在這種小鼠的Purkinje細(xì)胞里線粒體的形態(tài)是異常的，所以也有可能是因為其他原因?qū)е铝司€粒體功能的異常，使得線粒體的自噬水平升高，所以線粒體自噬在這個病理過程中仍然是起到了保護(hù)作用。
總之，線粒體自噬是細(xì)胞一個十分重要的過程，線粒體自噬的存在對于調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定十分必要。目前對線粒體自噬的研究剛剛起步，其中的分子機(jī)制遠(yuǎn)不清楚，而且線粒體自噬和機(jī)體發(fā)育生長以及疾病之間的關(guān)系仍然不是特別明了。我們新鑒定的線粒體自噬的受體將很大地推動線粒體自噬調(diào)控機(jī)制及線粒體質(zhì)量控制在疾病發(fā)生中的作用的研究。