相關(guān)論壇
凌今，凌人，黃彬彬，葉煒劍，叢維濤，金利泰
中國醫(yī)藥生物技術(shù)2013年4月第8卷第2期
作者單位：325035，溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)中心(凌今、黃彬彬、葉煒劍、叢維濤、金利泰)；
321000浙江金華廣福醫(yī)院病理科(凌人)；
321000浙江金華市人民醫(yī)院藥劑科(凌今)
收稿日期：2012-11-30
短暫的缺血會對器官造成損傷，但是在恢復(fù)灌注后，損傷反而進一步加劇，這種現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)。臨床上涉及缺氧/復(fù)氧過程的手術(shù)都不可避免地會發(fā)生IRI，比如重大器官的移植、冠脈搭橋、溶栓術(shù)等。IRI一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點，近年來研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注(ischemiareperfusion，IR)時，鈣超載、供能不足和氧自由基的大量產(chǎn)生等理化因素刺激細胞，誘發(fā)信號介導(dǎo)的細胞損傷、凋亡是造成IRI的一個重要原因。本文就IRI與信號通路的研究進展做簡要綜述。
1缺血再灌注損傷
缺血時器官以無氧酵解方式呼吸供能，胞內(nèi)累積大量乳酸，pH下降。再灌注時，細胞為了恢復(fù)正常的pH水平，泵入Na+以交換H+，但Na+過量引發(fā)了Ca2+內(nèi)流，迅速升高的Ca2+造成細胞鈣超載，導(dǎo)致死亡。過量生產(chǎn)的活性氧(reactiveoxygen species，ROS)在IRI的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的推動作用，即使在臨床手術(shù)時應(yīng)用抗氧劑，其損傷往往也難以有效遏制。缺血發(fā)生時，細胞降低代謝水平來適應(yīng)供能供氧不足的情況，再灌注時，細胞代謝水平迅速恢復(fù)正常，但氧化供能短時間無法滿足其需求，這也是造成細胞損傷的又一原因。功能細胞是器官的關(guān)鍵組成，代謝非常活躍，因而易受到致命的影響。功能細胞的大量死亡宏觀表現(xiàn)為器官的功能障礙，暫時或長久性的功能障礙即缺血再灌注損傷。
2細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
生物體是由一群具有特殊結(jié)構(gòu)與功能的細胞并由細胞膜組成的復(fù)雜有機體，其內(nèi)的大分子、細胞器、細胞、組織和器官在空間上是相互隔離的，且大多數(shù)細胞不與外界環(huán)境直接接觸，因此多細胞生物對外界的刺激(包括物理、化學(xué)、生物因素)需要細胞間復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)通過級聯(lián)系統(tǒng)傳遞，從而調(diào)控機體內(nèi)功能各異細胞的新陳代謝和行為，以保證整體生命活動的正常進行?？梢哉f，所有重要的生命現(xiàn)象都與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通常是指細胞通過細胞表面受體接受外界信號，通過系統(tǒng)級聯(lián)傳遞機制，將細胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為胞內(nèi)信號，引起細胞生理反應(yīng)或誘導(dǎo)特定基因的表達，引起細胞的應(yīng)答反應(yīng)。病理狀態(tài)下，細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生改變，其中一部分級聯(lián)信號激活自身防御及代償機制，提高機體對疾病的抗性；另一部分信號則誘發(fā)細胞代謝紊亂，介導(dǎo)細胞凋亡，促進疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，探究疾病狀態(tài)下信號轉(zhuǎn)導(dǎo)變化，可以為臨床治療開辟一條嶄新的道路。
3缺血再灌注的病理生理學(xué)特點
在病理條件下，冠脈閉塞15～20 s，糖酵解隨即成為高能磷酸化供能的僅有方式。雖然短時間內(nèi)可以維持心肌細胞的基礎(chǔ)能量需求，但是當缺血時間延長至60～90 min時，提供ATP的無氧酵解過程基本停滯，細胞幾無能量供應(yīng)，梗死面積逐步擴大，心臟攣縮。
再灌注時，心臟的能量需求恢復(fù)，然而功能的恢復(fù)卻相對滯后，緩慢地達到缺血前的狀態(tài)，這個現(xiàn)象被稱為心肌鈍抑。鈍抑的心肌往往消耗大，做功少，效率低下。這主要是因為在再灌注時脂肪酸氧化、糖酵解和丙酮酸氧化速率大幅升高。高速率的脂肪酸β氧化很大地抑制了葡萄糖氧化，致使葡萄糖氧化和糖酵解水平失衡。血漿內(nèi)的高濃度游離脂肪酸可進一步抑制丙酮酸的氧化。如果糖酵解與葡萄糖氧化偶聯(lián)，那么糖酵解不產(chǎn)生H+。然而如果糖酵解不與葡萄糖氧化偶聯(lián)，丙酮酸則酵解生成乳酸，這個過程中由于ATP的水解，每個葡萄糖分子凈生成2個H+。這種葡萄糖氧化和酵解的解耦合作用是心臟內(nèi)H+的主要來源。代償供能產(chǎn)生的H+蓄積于細胞內(nèi)，再灌注時細胞會把Na+泵入胞內(nèi)，置換出H+，從而恢復(fù)pH值到正常水平。Na+的大量流入刺激了細胞內(nèi)的Na+與細胞外的進行Ca2+交換，Na+/Ca2+的交換效率很高，細胞內(nèi)Ca2+很快出現(xiàn)超載現(xiàn)象，導(dǎo)致了細胞的死亡。
基于上述細胞代謝的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體膜上非選擇性的通道——線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)是再灌注損傷的決定性因素。再灌注期間，線粒體通透性決定了細胞存亡：如果通透性較小，細胞可能恢復(fù)；通透性中等，細胞發(fā)生凋亡；通透性大，細胞則因為能量供應(yīng)不足而壞死。在心肌缺血期間mPTP是關(guān)閉的，僅在再灌注的前幾分鐘開啟，以適應(yīng)線粒體鈣超載、氧化應(yīng)激、pH的恢復(fù)以及ATP耗竭。這個通道的開放破壞了線粒體膜電位，阻斷了氧化磷酸化，導(dǎo)致了ATP的耗竭，細胞死亡。
此外，細胞內(nèi)諸如H+、Ca2+量的改變破壞了線粒體膜電位，導(dǎo)致了活性氧自由基的產(chǎn)生?；钚匝鯐苯訐p傷DNA、蛋白質(zhì)、脂類，這種非特異性的損傷經(jīng)過細胞因子介導(dǎo)，生成腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α過表達的TNF-α與心肌細胞上的腫瘤壞死因子受體結(jié)合，引起心臟收縮功能障礙、心肌肥大、纖維化和細胞死亡。胞內(nèi)過量的Ca2+與焦磷酸形成復(fù)合物，同時產(chǎn)生尿酸，磷酸鈣和尿酸被稱為“危險信號”，都是強炎癥刺激物。炎癥刺激物包括現(xiàn)有炎性分子的增多以及白細胞介素-1β(interleukin1β，IL-1β)的分泌等。這些炎性物質(zhì)刺激Toll樣受體(TLRs)進而通過激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)促進炎性細胞因子和趨化因子產(chǎn)生。在再灌注的起初6 h，梗死區(qū)域內(nèi)中性粒細胞趨化因子釋放，并在未來24h遷移到心肌組織。此過程促進中性粒細胞黏附，引起血管堵塞，并釋放降解酶和更多的ROS。正如上文所述，這些代謝變化又直接影響組織的炎癥和完整性，甚至細胞的存活。
4缺血再灌注損傷與信號通路
4．1 Toll樣受體4信號通路
Toll樣受體4(Toil-likereceptor 4，TLR-4)是1997年Rock等初次發(fā)現(xiàn)的一種類果蠅源的Toll樣受體，在人體內(nèi)分布較為廣泛。TLR-4介導(dǎo)的信號通路包括髓樣細胞分化因子88(myeloiddifferentiation factor 88，MyD88)依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑。MyD88依賴性途徑是通過其與TLR-4相互作用，經(jīng)TIR區(qū)域向細胞內(nèi)傳遞信號，活化NF-κB進入細胞核，誘導(dǎo)一系列特定基因的表達，引起多種炎性細胞因子的釋放，造成細胞損傷。
Wang等采用BALB/c小鼠和TLR-4先天性缺損小鼠(C3H/HeJ)研究肝臟IRI。實驗發(fā)現(xiàn)，C3H/HeJ組小鼠肝功能損傷程度、血清TNF-α水平顯著低于對照組，提示TLR-4受體激活，可增加TNF-α參與肝臟IRI損傷。Zhai等進一步研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4敲除對小鼠肝臟IRI有保護作用，而TLR-2敲除無此作用。Oyama等在小鼠心肌IR模型中發(fā)現(xiàn)，TLR-4缺陷型小鼠(C57/BL10ScCr)心肌中多形核白細胞(polymorphonuclear，PMN)浸潤顯著減少，炎癥反應(yīng)減輕，心肌梗死面積較小。Chong等采用C3H/HeJ(TLR-4基因缺失)小鼠復(fù)制了心肌IRI實驗，驗證了TLR-4介導(dǎo)心肌IRI損傷的結(jié)論。Wu等在研究腎臟IRI時發(fā)現(xiàn)，缺血后腎小管上皮細胞存在TLR-4表達和PMN浸潤，而TLR-4缺陷型小鼠在IR后腎功能和腎實質(zhì)損傷明顯減輕。同時，在MyD88缺陷型小鼠身上觀察到和TLR-4缺陷型小鼠一樣的保護作用，說明TLR-4通過MyD88依賴性信號通路介導(dǎo)IRI。后來，Hua等研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4缺失型小鼠保護心肌IRI的作用可被磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(phoshatidylinositol-3-kinase-serine/threonine kinase，PI3K/Akt)抑制劑消除，提示TLR-4和PI3K/Akt通路存在交叉，TLR-4-/-小鼠抗心肌IRI是通過PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的。
4．2缺氧誘導(dǎo)因子信號通路
細胞感知氧水平改變，供氧不足時改變細胞生理狀態(tài)，通過缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducibletranscription factor，HIF)氧敏感性轉(zhuǎn)錄通路，結(jié)合缺氧調(diào)控元件(HRE)，調(diào)控多種基因表達，提高細胞對缺氧的適應(yīng)性。同時，HIF在IRI中也表現(xiàn)為一種有益因子。Nataraian等通過siRNA干擾小鼠微血管內(nèi)皮細胞PHDs表達來增加HIF的表達，發(fā)現(xiàn)iNOS表達也隨之增加，IR后，梗死面積顯著減少。然而，iNOS基因敲除的小鼠無抗IRI的作用。Xi等在體外模型中應(yīng)用氯化鈷激動HIF，發(fā)現(xiàn)能減少梗死面積，而在iNOS敲除的小鼠器官中則沒有觀察到保護作用。這些研究表明，在IRI中，HIF可以上調(diào)iNOS消除IR產(chǎn)生的ROS發(fā)揮保護作用。
Pachori等用RNA技術(shù)誘導(dǎo)大鼠血紅素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1)過表達，觀察到HO-1過表達的大鼠心臟、肝臟等器官在發(fā)生IR時損傷減輕，這是由于HO-1及其催化產(chǎn)生的血膽紅素、CO均具有抗氧化應(yīng)激損傷的作用。HO-1催化氧化需消耗大量氧分子，競爭了氧自由基的氧來源，減少氧自由基的產(chǎn)生。膽紅素能清除活性氧，在多種疾病中發(fā)揮抗氧化作用，而CO在一定范圍內(nèi)可減少ROS的生成。再灌注時HIF上調(diào)，誘導(dǎo)HO-1表達增加，通過上述途徑發(fā)揮抗氧化作用，減輕器官的再灌注損傷，這可能是HIF抗IRI的又一途徑。
4．3促分裂素原活化蛋白激酶途徑
促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases，MAPKs)途徑是介導(dǎo)細胞反應(yīng)的重要信號系統(tǒng)，參與了細胞生長、發(fā)育、分裂、死亡以及細胞間的功能同步等多種生理反應(yīng)的過程。MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，由多種同工酶組成，主要包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulated protein kinases，ERK)、c-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38MAPK。
4．3．1 ERK信號通路
ERK被認為是經(jīng)典的MAPK信號通路途徑。研究發(fā)現(xiàn)，ERK在正常細胞中低表達，而受到IR的刺激后，pERK顯著上調(diào)。對于IR刺激下ERK通路的激活，是發(fā)揮保護作用還是介導(dǎo)凋亡，學(xué)術(shù)界尚無定論。
部分學(xué)者認為ERK通路激活在IRI中發(fā)揮保護作用。Tao等研究發(fā)現(xiàn)，1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，SIP)通過激活ERK促進成年小鼠心肌細胞在IR模型中的存活。Yue等和Das等報道激活ERK通路可減少IR誘發(fā)的細胞凋亡，宏觀上縮小心肌梗死的面積。ERK通路可能通過如下幾個方面發(fā)揮保護作用：
①ERK促進B細胞淋巴瘤基因2(B-celllymphoma gene 2，Bcl-2)表達，拮抗凋亡蛋白Bax表達，減少caspases-3活化；
②Bcl-2與c-myc共同阻止p53入核及其誘導(dǎo)細胞凋亡作用；
③ERK激活核糖體S6蛋白激酶(RSK)可使環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP)磷酸化，協(xié)同抑制細胞凋亡，促進細胞存活；
④ERK激活可提高ATP水平，恢復(fù)供能；
⑤可拮抗JNK，p38信號通路的促凋亡作用。
另外一部分學(xué)者則持相反觀點。Stanciu等、Tsoporis等和Tong等在各自的研究中發(fā)現(xiàn)，激活ERK通路會導(dǎo)致培養(yǎng)的細胞的IRI加重。更多的研究分析ERK可能通過以下途徑介導(dǎo)損傷：
①ERK是p53的上游信號分子，pERK可激活p53磷酸化，介導(dǎo)細胞凋亡；
②ERK激活后通過ERK1/2/Elk/Egr-1通路上調(diào)Egr-1蛋白，介導(dǎo)IR損傷；
③ERK激活miR-1和miR-206抑制Hsp60表達，削弱Hsp60保護作用，加重器官IRI；
④ERK激活可導(dǎo)致活性氧(ROS)產(chǎn)生增加，引起IRI。
ERKs作為MAPKs中經(jīng)典通路，參與了細胞生理、病理過程。不同的實驗發(fā)現(xiàn)ERK在IR中扮演了截然相反的角色，這可能與IRI進程有關(guān)。IRI早期，ERK的激活可啟動內(nèi)源性的保護機制，而在IRI中晚期則以介導(dǎo)細胞損傷為主。
4．3．2 JNK通路
JNK位于細胞質(zhì)中，當IR刺激激活JNK發(fā)生磷酸化時，pJNK轉(zhuǎn)入細胞核中參與細胞增殖、代謝、凋亡等調(diào)控。Ferrandi等在大鼠心肌IR模型中應(yīng)用AS601245(JNK選擇性抑制劑)可以減少細胞凋亡和梗死面積。Okuno等研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血區(qū)的pJNK水平增高，應(yīng)用JNK抑制劑SP600125可以阻止Bax從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核，抑制神經(jīng)元的凋亡。Carboni等應(yīng)用抑制劑AS601245處理小鼠神經(jīng)細胞可有效減輕IRI。大量實驗發(fā)現(xiàn)，IR發(fā)生時，JNK活性顯著升高。其抑制劑可降低IR引起的細胞凋亡，提示JNK參與了IRI的進程。
JNK在IRI中介導(dǎo)細胞凋亡主要有兩個機制：
①轉(zhuǎn)錄因子途徑：JNK激活后調(diào)控下游因子轉(zhuǎn)錄，上調(diào)凋亡蛋白表達，介導(dǎo)凋亡途徑引起細胞凋亡，如：JNK活化后進入細胞核，啟動轉(zhuǎn)錄因子和ATF-2、AP-1、Elk-1等，誘發(fā)FasL、TNF-2、BH3-only蛋白表達上調(diào)，激活凋亡程序；
②非轉(zhuǎn)錄因子途徑：部分活化的JNK不進入細胞核，不參與轉(zhuǎn)錄、調(diào)控，而是在細胞質(zhì)中直接作用于Bcl-2，引起線粒體通透性的改變，誘發(fā)細胞凋亡。
4．3．3 p38 MAPK信號通路
p38 MAPK是MAPKs中的又一重要通路?；罨膒38在細胞成活、分化、發(fā)育、炎癥以及應(yīng)激反應(yīng)等生理、病理進程中發(fā)揮重要作用。IR發(fā)生時，釋放的氧自由基和細胞因子激活p38 MAPK，將胞外刺激傳遞到胞內(nèi)，引起蛋白表達改變，誘發(fā)細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在再灌注前使用p38 MAPK特異性阻滯劑SB203580、FR167653等可以有效抑制p38MAPK的激活，減少再灌注器官的損傷。p38 MAPK通過以下幾個途徑介導(dǎo)細胞凋亡：
①上調(diào)c-myc表達，c-myc是細胞凋亡的主要誘因；
②促進p53磷酸化；
③參與Fas介導(dǎo)的凋亡；
④激活c-Jun和c-fos；
⑤誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位；
⑥激活NF-κB，提高TNF-α等炎性因子表達，誘發(fā)細胞炎性損傷。
細胞的炎性損傷和凋亡導(dǎo)致再灌注器官的功能障礙和衰竭。
4．4磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路
Akt是PI3K/Akt通路的核心，也是PI3K下游的直接作用靶點。許多細胞因子、生長因子、理化刺激均可以活化PI3K，從而磷酸化Akt，激活下游級聯(lián)反應(yīng)和靶蛋白之間的相互作用。
大量研究表明，在IR發(fā)生時，激活PI3K/Akt信號通路可以顯著抑制心肌細胞凋亡，縮小梗死面積。Li等發(fā)現(xiàn)，胰島素與受體結(jié)合，可激活其受體的酪氨酸激酶，進一步激活PI3K/Akt通路，上調(diào)下游靶蛋白p70S6K和eNOS，產(chǎn)生保護心肌的作用。Raphael等應(yīng)用異氟烷預(yù)處理兔體，發(fā)現(xiàn)其心臟在IRI中梗死面積和凋亡細胞減少，Westernblot顯示pAkt、pBad和Bcl-2上調(diào)，而Bax下調(diào)，PI3K抑制劑可拮抗該保護作用，提示PI3K/Akt活化后可減少Bad介導(dǎo)的細胞凋亡，參與了異氟烷對IRI的保護作用。馬亞飛等研究發(fā)現(xiàn)，葛根素預(yù)處理亦可對抗心肌IRI，這種保護作用可以被Akt選擇性抑制劑LY294002阻斷，推測葛根素的保護作用可能也與PI3K/Akt信號通路的激活有關(guān)。王巖采用分別給予PI3K、Akt、eNOS抑制劑的方法干預(yù)普伐他汀對心肌IRI的保護作用，結(jié)果顯示PI3K、Akt、eNOS均可特異性拮抗普伐他汀對兔心肌IRI的保護作用，顯示普伐他汀通過PI3K/Akt/eNOS信號通路發(fā)揮作用。
實驗觀察到不同種類藥物發(fā)揮IRI保護作用時均激活了PI3K/Akt信號通路，而特異性抑制劑拮抗其保護作用，說明PI3K/Akt通路的激活對心臟起保護作用。更多研究表明，活化Akt能作用于下游eNOS、Bcl-2、GSK-3β、caspase-9、p70S6K等多個靶點，并減少mPTP的開放，穩(wěn)定線粒體膜，減少促凋亡因子活化，發(fā)揮抗凋亡、保護再灌注器官的作用。
5總結(jié)與展望
綜上所述，HIF作為特異性氧敏感性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在缺血及再灌注2個損傷環(huán)節(jié)均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。MAPKs在IR時激活，ROS與MAPK通路存在交互作用，ROS能誘導(dǎo)MAPK的激活，同時這些激酶亦可反作用調(diào)節(jié)ROS水平。p38被證實可以調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)ROS水平，通過Raf/MEK/ERK通路對抗線粒體內(nèi)過多的ROS和Ca2+，減少細胞凋亡。然而ERK是否起到細胞保護作用仍然未有定論。另一方面，先天免疫和炎癥在IRI中已有深入研究，促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子在IR時表達增加。Toll樣受體是這些免疫和炎癥誘導(dǎo)物的結(jié)合受體，它在炎癥誘導(dǎo)的IRI中起核心作用。細胞損傷時釋放的高遷移率蛋白(HMGB1)是一種TLRs配體。ROS可通過上調(diào)HMGB1，增加其與TLRs結(jié)合來激活NF-κB，經(jīng)NF-κB信號介導(dǎo)在IRI時調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生。在諸如腦、肺、肝、腎、腸等器官中也觀察到了相似的作用。此外，PI3K/Akt的激活可以對抗缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。心肌缺失TLR-4小鼠的NF-κB結(jié)合激活減少以及Akt磷酸化水平增加，不易發(fā)生IRI，而使用小分子抑制PI3K可以完全消除TLR-4缺失小鼠的IRI心肌保護作用，提示TLR-4和PI3K/Akt通路存在交叉。
目前，在臨床上防治IRI并無特效藥物，隨著IRI與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的不斷深入，對IRI發(fā)病機制的了解也越發(fā)透徹，這為防治IRI新藥的研發(fā)提供了更多嶄新的思路。