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高前進(jìn)李壯志馬新東王瑞元
《北京體育大學(xué)學(xué)報(bào)》2005年10期
【摘要】：
隨著研究的逐漸深入和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)，人們對(duì)細(xì)胞骨架有了豐富的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞骨架包括微絲、微管和中等纖維，其在細(xì)胞中具有多種重要的生物學(xué)功能。
在骨骼肌細(xì)胞中細(xì)胞骨架按位置不同分為肌小節(jié)內(nèi)、肌小節(jié)外和肌細(xì)胞膜骨架蛋白。
結(jié)蛋白desmin是骨骼肌細(xì)胞中主要的中等纖維，是重要的骨架蛋白。
整聯(lián)蛋白integrins和抗肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白dystrophin復(fù)合物通過(guò)亞細(xì)胞膜分子和跨膜分子將骨骼肌的收縮成分與細(xì)胞外基質(zhì)相連。
細(xì)胞骨架能穩(wěn)定肌小節(jié)結(jié)構(gòu)，由于肌節(jié)過(guò)度伸展或蛋白酶激活可能會(huì)損傷骨架蛋白。這些可能是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練造成肌肉微損傷和骨骼肌疾病癥狀，例如肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：骨骼??；細(xì)胞骨架；結(jié)蛋白；抗肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白
1、細(xì)胞骨架概述
細(xì)胞骨架按其功能性可下這樣的一個(gè)定義，即它們是負(fù)責(zé)細(xì)胞空間組織的結(jié)構(gòu)。細(xì)胞骨架分為三種類(lèi)型的蛋白質(zhì)纖維，即微絲(microfilament)、微管(microtubule)和中等纖維(intermediatefilament)。它們分別是不同蛋白質(zhì)以不同方式組裝成不同直徑的纖維?，F(xiàn)在這些纖維蛋白質(zhì)都能在體外解離和重新裝配，使得人們能夠?qū)λ鼈兊幕瘜W(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。
微絲專(zhuān)指由肌動(dòng)蛋白(actin)組成的、直徑約7nm的纖維。肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白(myosin)早已知是在細(xì)胞中更普遍，可能也是更主要的利用細(xì)胞化學(xué)能產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)的機(jī)械-化學(xué)系統(tǒng)。所有的真核細(xì)胞都含有肌動(dòng)蛋白，并且在多數(shù)細(xì)胞中，它是含量非常高的細(xì)胞質(zhì)蛋白。肌球蛋白在肌肉細(xì)胞和非肌肉細(xì)胞中總是和肌動(dòng)蛋白緊密相關(guān)的。其他一些結(jié)合蛋白可能與肌動(dòng)蛋白相互作用使微絲表現(xiàn)出獨(dú)特的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，并使之能夠執(zhí)行尤其多樣的功能，包括收縮和非收縮功能。
微管是直徑24～26 nm的管狀纖維，長(zhǎng)度變化很大，常延伸到像纖毛、鞭毛或某些原生動(dòng)物的軸偽足這樣一些長(zhǎng)的細(xì)胞突起中。微管是由α和β管蛋白和少量微管結(jié)合蛋白的聚合作用而形成的。微管蛋白是構(gòu)成微管的主要蛋白，它具有α和β兩型，兩個(gè)分子聯(lián)結(jié)在一起形成二聚體(dimers)，由它螺旋盤(pán)繞裝配成微管的壁。13個(gè)二聚體構(gòu)成一周，因此在微管的橫切面上有13個(gè)原纖維。微管實(shí)際上是所有真核細(xì)胞的生活周期或發(fā)育史的某個(gè)時(shí)候在其細(xì)胞里找到的一種用途異常多的蛋白質(zhì)聚合體，是真核細(xì)胞所僅有的普遍存在的結(jié)構(gòu)。
中等纖維和微管、微絲，是構(gòu)成細(xì)胞質(zhì)骨架的三種主要纖維，在電鏡下呈直徑8～11nm的中空管狀。由于其直徑在微管和微絲之間，被命名為中等纖維。從細(xì)胞水平來(lái)看，中等纖維在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成一個(gè)完整的支撐網(wǎng)架系統(tǒng)。它在外面與細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)直接聯(lián)系，在內(nèi)部與核表面利核基質(zhì)直接聯(lián)系，中間與微管、微絲及其他細(xì)胞器聯(lián)系，因此在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間都起著多方面的結(jié)構(gòu)作用。
在細(xì)胞內(nèi)，許多生物學(xué)上的過(guò)程需要有細(xì)胞骨架的參與。這包括有絲分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、對(duì)細(xì)胞質(zhì)的組織、細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞形態(tài)的維持以及膜相關(guān)的諸多功能等。目前隨著生物學(xué)研究技術(shù)的不斷改進(jìn)提高，使得細(xì)胞骨架的研究已從形態(tài)觀(guān)察為主，迅速推進(jìn)到分子結(jié)構(gòu)、功能利調(diào)節(jié)的研究。其豐富的研究成果及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的重要性已使其成為了一個(gè)熱門(mén)研究領(lǐng)域。
2、骨骼肌細(xì)胞骨架概念及分類(lèi)
骨骼肌細(xì)胞骨架由蛋白質(zhì)構(gòu)成，它的主要功能是聯(lián)結(jié)和錨定細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)成分。利用快速冷凍蝕刻技術(shù)可見(jiàn)，細(xì)胞質(zhì)充滿(mǎn)長(zhǎng)度利直徑不等的纖維，它們相互交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞骨架網(wǎng)中含有肌動(dòng)蛋白纖維、微管和中間絲蛋白纖維，這些纖維的交聯(lián)方式非常復(fù)雜。核糖體、細(xì)胞器被錨定在細(xì)胞骨架上。
骨骼肌細(xì)胞骨架按位置不同可分類(lèi)為肌小節(jié)內(nèi)骨架、肌小節(jié)外骨架和肌細(xì)胞膜骨架。
Tinin和Nebulin是肌小節(jié)內(nèi)的主要骨架蛋白，它們沿肌原纖維長(zhǎng)軸排列在肌節(jié)內(nèi)。Tinin從Z盤(pán)伸展到M帶，1983年Lashall等采用免疫電鏡初次發(fā)現(xiàn)tinin的定位，現(xiàn)在認(rèn)為tinin是連接Z盤(pán)和Myosin之間的蛋白絲，從Z盤(pán)至M線(xiàn)，在肌節(jié)中具有一定的彈性，并維持Myosin的中間狀態(tài)。Nebulin在細(xì)胞中的定位是1988發(fā)現(xiàn)的，在肌肉放松的狀態(tài)下nebulin起源于Z盤(pán)，延伸至I帶，連接于Z盤(pán)與Z盤(pán)之間，與A帶中的actin平行排列，主要作用是保持actin的正常結(jié)構(gòu)。
肌小節(jié)外細(xì)胞骨架主要由中等纖維(intermediatefilaments)組成，它位于肌原纖維周?chē)?，連接Z盤(pán)、核膜和肌細(xì)胞膜之間。在骨骼肌細(xì)胞確認(rèn)的一些中等纖維包括desmin、vimentin、nestin、synemin、paranemin、lamins andcytokeratins。然而，主要的肌肉特異性的中等纖維是desmin，其位于肌節(jié)Z盤(pán)周?chē)B接相鄰的Z盤(pán)與肌細(xì)胞膜。
肌細(xì)胞膜骨架蛋白包括跨膜的和與膜相連的蛋白，例如vincullin、spectrin、dystrophin、integrins、ankyin等，這些蛋白將肌細(xì)胞內(nèi)的肌原纖維和細(xì)胞外的基質(zhì)間接地聯(lián)結(jié)起來(lái)，這種聯(lián)結(jié)是通過(guò)細(xì)胞膜上專(zhuān)門(mén)的區(qū)域costameres(肋小節(jié))(圖1)。Costameres在肌細(xì)胞膜上呈周期性分布，costameres包含兩套細(xì)胞-基質(zhì)相互作用受體復(fù)合物dystrophin-glycoprotein complex(DGC)和integins-talin、vinculin complex。Dystrophin-glycoprotein complex(DGC)是細(xì)胞膜上主要的具有重要功能的結(jié)構(gòu)，也稱(chēng)為dystrophin-associated protein complex(DAPC)。這個(gè)復(fù)合物是多分子的跨膜復(fù)合物，聯(lián)結(jié)細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白和細(xì)胞外基膜。由DGC調(diào)節(jié)的這種聯(lián)結(jié)對(duì)維持肌細(xì)胞完整性和肌力的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用。DGC包含細(xì)胞外的和跨細(xì)胞膜的蛋白復(fù)合物α/β-dystroglycan、sarcoglycan的四個(gè)亞單位和sarcospan。α/β-dystroglycan是一個(gè)異源二聚體，與細(xì)胞外基質(zhì)laminin-2相聯(lián)結(jié)。DGC復(fù)合物的跨膜成分與信號(hào)分子nNOS，dystrophin相聯(lián)。
DGC復(fù)合物基因變異可導(dǎo)致各種肌營(yíng)養(yǎng)不良癥。例如，杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD，Duchemae MuscularDystrophy)是由于缺乏dystrophin；貝克爾肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(BMD，BeckerMuscular Dystrophy)由于dystrophin以截短的形式表達(dá)；肢帶肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(LGMD，Limb-girdleMuscular dystrophies)，由于Sarcoglycans亞單位中的某一個(gè)變異所致。先天性基質(zhì)肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(CMD，MerosinCongenital Muscular Dystrophy)由于基質(zhì)中缺乏laminin-2所致(圖2)。由于DGC在人類(lèi)骨骼肌疾病中有重要意義，因此DGC已成為眾多研究的焦點(diǎn)。在肌肉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，DGC對(duì)維持神經(jīng)-肌肉接觸點(diǎn)和肌肉-肌腱聯(lián)結(jié)點(diǎn)的成熟和穩(wěn)定都發(fā)揮著重要作用。
在肌細(xì)胞膜上另一個(gè)關(guān)鍵性的結(jié)構(gòu)是integrinsassociated to talin and vinculin complex。它與細(xì)胞基膜中l(wèi)aminin的各個(gè)亞型都有聯(lián)結(jié)，在細(xì)胞內(nèi)與微絲相聯(lián)結(jié)。對(duì)細(xì)胞彼此之間的附著相當(dāng)重要，還參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
3、運(yùn)動(dòng)和骨骼肌細(xì)胞骨架蛋白
3．1 Desmin與骨骼肌微損傷機(jī)制
在骨骼肌細(xì)胞內(nèi)除收縮蛋白以外，肌細(xì)胞還包括骨架蛋白。骨架蛋白在肌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定和聯(lián)結(jié)收縮蛋白，使收縮產(chǎn)生的張力沿肌纖維長(zhǎng)軸利肌纖維的側(cè)面?zhèn)鬟f。肌細(xì)胞內(nèi)的骨架蛋白對(duì)預(yù)防骨骼肌離心收縮造成的損傷有重要作用。Desmin是細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)利胞外基質(zhì)聯(lián)結(jié)系統(tǒng)中的一個(gè)重要的蛋白，可能是離心收縮引起肌小節(jié)紊亂的重要機(jī)制。Desmin是位于Z盤(pán)周?chē)?lián)結(jié)Z盤(pán)和Z盤(pán)，同時(shí)將Z盤(pán)和肌細(xì)胞膜聯(lián)結(jié)到一起的結(jié)構(gòu)蛋白，在穩(wěn)定肌節(jié)結(jié)構(gòu)和沿肌纖維各個(gè)方向傳遞張力的過(guò)程發(fā)揮重要作用。Lieber和Friden等在一組系列的研究中，使用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究了Desmin可能發(fā)生的變化。在頭一個(gè)實(shí)驗(yàn)中他們研究認(rèn)為在一些肌纖維Desmin蛋白缺失是離心運(yùn)動(dòng)造成肌肉損傷的特點(diǎn)，而且Desmin蛋白丟失的肌細(xì)胞在損傷后即刻收縮蛋白結(jié)構(gòu)正常。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，Lieber等使用在兔后腿皮下植入電極刺激坐骨神經(jīng)，使后腿產(chǎn)生離心收縮，觀(guān)察了兔脛骨前肌利趾長(zhǎng)伸肌中desmin隨時(shí)間變化而丟失的情況，一開(kāi)始的結(jié)構(gòu)改變是5min后趾長(zhǎng)伸肌(EDL)即有2．5％±0．63％的desmin標(biāo)記丟失(P<0．05)，脛骨前肌(TA)丟失不明顯(0．24％±0．19％)，但是15min后，EDL利TA的desmin丟失率分別達(dá)到7．4±1．4％和4．6±1．0％(P<0．05)，第3 d時(shí)達(dá)到高峰，分別丟失30％以上和15％左右。Komulainen利用大鼠模型也發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后即刻和6h后desmin標(biāo)記丟失。這些結(jié)果表明Desmin蛋白丟失可能是離心運(yùn)動(dòng)損傷的一個(gè)早期特點(diǎn)，這些Desmin染色陰性肌纖維后來(lái)很多都顯示出tinin染色增多和至后出現(xiàn)收縮蛋白降解變性。這些研究形成了對(duì)離心運(yùn)動(dòng)損傷機(jī)制的假說(shuō)：
1)肌纖維被動(dòng)過(guò)度伸展引發(fā)了肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子局部升高；這種增高可能是由于被動(dòng)張力刺激張力敏感離子通道使該離子內(nèi)流，或是由于肌漿網(wǎng)受損不能將鈣離子泵回肌漿網(wǎng)，或是由于T管系統(tǒng)或肌細(xì)胞膜受損所致。
2)細(xì)胞內(nèi)升高的鈣離子激活蛋白酶，例如calpain，導(dǎo)致選擇型地中性蛋白水解，中等纖維網(wǎng)分解。已經(jīng)證實(shí)Desmin是calpain的作用底物，而actin利myosin不是，這可以解釋為什么Desmin標(biāo)記丟失的纖維收縮蛋白結(jié)構(gòu)仍然完好。
3)至后由于蛋白酶水解作用使Desmin網(wǎng)被破壞，肌原纖維結(jié)構(gòu)被破壞，不能產(chǎn)生正常的收縮力。
Belcastro也匯報(bào)了在跑臺(tái)跑后，大鼠后肢肌肉有增高的calpain活動(dòng)。他認(rèn)為先是機(jī)械外力引發(fā)肌細(xì)胞損傷，然后是肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多，導(dǎo)致后期的炎性反應(yīng)。
3．2骨骼肌細(xì)胞膜骨架蛋白與肌肉微損傷機(jī)制
運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肌肉酸痛(Exercise-inducemuscle soreness)肌肉微損傷(Exercise-induce mus-cle damage)是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和體育鍛煉中非常普遍的現(xiàn)象。Hough在1902年先建議運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的延遲性肌肉酸痛是由于肌纖維損傷引起。隨后，大量的研究認(rèn)為，劇烈的、超過(guò)習(xí)慣負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)(尤其包含離心收縮的運(yùn)動(dòng))會(huì)使肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)損傷，而且這種損傷伴隨著肌肉功能下降。組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察對(duì)肌細(xì)胞膜，肌原纖維和骨架蛋白的損傷提供了直接的證據(jù)。然而骨骼肌微損傷的機(jī)制仍然不清楚。目前對(duì)其損傷機(jī)制主要有幾種假說(shuō)，如：
1)機(jī)械假說(shuō)：在肌肉收縮和彈性成分中，由于高張力(尤其是伴隨離心收縮的)運(yùn)動(dòng)會(huì)造成結(jié)構(gòu)的損害；
2)自由基攻擊假說(shuō)，認(rèn)為運(yùn)動(dòng)使氧自由基增加，脂質(zhì)過(guò)氧化加強(qiáng)，從而使細(xì)胞膜受到攻擊損傷，進(jìn)而肌細(xì)胞內(nèi)容物漏出；
3)骨骼肌收縮蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白代謝平衡：胞漿鈣、線(xiàn)粒體鈣大量堆積，抑制細(xì)胞呼吸，造成氧化磷酸化的損害，使細(xì)胞內(nèi)鈣進(jìn)一步升高，激活鈣依賴(lài)蛋白水解酶，使Z線(xiàn)、肌蛋白酶和原肌球蛋白降解，對(duì)肌纖維結(jié)構(gòu)造成了嚴(yán)重的損害。
以上幾種假說(shuō)一致認(rèn)為肌細(xì)胞膜損傷、肌細(xì)胞膜完整性的喪失是胞漿內(nèi)容物泄漏和胞外鈣離子大量進(jìn)入的直接原因。因此對(duì)骨骼肌細(xì)胞膜尤其是細(xì)胞膜骨架蛋白和膜上離子通道的研究引起了學(xué)者們的巨大興趣。Dystrophin是抗肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白聚糖復(fù)合物(dystrophinglycoprotein complex DGC)的主要成分，DGC跨細(xì)胞膜連接著肌細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白和細(xì)胞外的基質(zhì)。這種跨膜復(fù)合物的丟失、分解使收縮引起的肌纖維損傷大大增加，使肌細(xì)胞膜損傷導(dǎo)致肌纖維壞死。
Richard和DonatellaBiral用熒光免疫標(biāo)記抗體的方法研究了離心收縮后骨骼肌細(xì)胞膜骨架蛋白(a-actinin、desmin、dystrophin、sarcoglycan、β-spectrin)和細(xì)胞間質(zhì)蛋白(laminin，fibroneetin)的變化。在離心運(yùn)動(dòng)引起的損傷后，肌纖維之間有明顯的dystrophin標(biāo)記丟失，而其它膜骨架蛋白受影響很小。說(shuō)明dystrophin更易受到攻擊，并且其可能在力量傳遞中占有重要地位。
Sarcoglycan(肌聚糖蛋白)是一個(gè)多分布、位于膜上的蛋白聚糖復(fù)合物，與DGC相連。人類(lèi)sarcoglycan基因變異引起肢帶肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥(limb-girdle musclar dystrophy LGMD)；而Dystrophin基因變異引起杜氏或貝克爾肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne/Becker muscular drstrophy DMD/BMD)。L．Feasson，D．Stockhohn等人應(yīng)用蛋白免疫印跡分析法研究了離心運(yùn)動(dòng)引起的人肌細(xì)胞膜損傷的情況，發(fā)現(xiàn)離心收縮使a-sarcoglycan分解、丟失，Desmin沒(méi)有變化，運(yùn)動(dòng)后14d desmin合成增加有顯著性意義，而a-sarcoglycan14 d時(shí)蛋白水平仍然處于較低水平，作者還在此基礎(chǔ)上研究了小熱休克蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)引起的Hsp27、aB-晶狀體蛋白表達(dá)逐漸增加，運(yùn)動(dòng)后1d蛋白表達(dá)達(dá)峰值，14d仍然處于較高水平與對(duì)照組相比有顯著差異。作者認(rèn)為a-sarcogiycan屬于DGC復(fù)合物，對(duì)穩(wěn)定肌細(xì)胞膜起重要作用，雖然a-sarcoglycan表達(dá)水平下降的準(zhǔn)確意義不明，但是可以肯定其丟失是與內(nèi)容物CK、LDH、肌球蛋白等的泄漏相關(guān)，此結(jié)果是與a-sarcoglycan基因敲除鼠表現(xiàn)出的肌膜完整性喪失，肌力下降，和顯著的DGC不穩(wěn)定的結(jié)果相一致的。a-sarcoglycan蛋白水平的降低也可能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，因?yàn)?，a-sarcoglycan有一個(gè)細(xì)胞外ATPase的活動(dòng)，其減少時(shí)ATP酶增多，進(jìn)而使P2X受體活動(dòng)增強(qiáng)，P2X受體是一個(gè)非特異性的離子通道，a-sarcoglycan蛋白水平的下降可導(dǎo)致持續(xù)的P2X受體活動(dòng)，而使胞內(nèi)鈣超載。
以上的研究表明了膜骨架蛋白dystrophin和sarcoglycan在保持細(xì)胞膜完整性方面的重要性。這些骨骼肌細(xì)胞膜DGC復(fù)合物成份丟失發(fā)生在骨架蛋白desmin染色丟失之前或者發(fā)生在actin出現(xiàn)紊亂之前，因此這些蛋白復(fù)合物缺失可能有一個(gè)引發(fā)一系列損傷事件的源頭作用。對(duì)于接下來(lái)的肌原纖維再重建和預(yù)防下一次的離心運(yùn)動(dòng)損傷具有意義。
4、小結(jié)
運(yùn)動(dòng)性骨骼肌微損傷和延遲性肌肉酸痛多年來(lái)一直是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞骨架遭到破壞可導(dǎo)致骨骼肌微損傷和延遲性肌肉酸痛，因?yàn)榧?xì)胞骨架蛋白對(duì)維持肌節(jié)的正常結(jié)構(gòu)起著非常重要的作用，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，高張力的機(jī)械牽拉會(huì)使細(xì)胞骨架的正常結(jié)構(gòu)受到影響，從而造成肌肉收縮蛋白結(jié)構(gòu)破壞。中間絲蛋白desmin和膜骨架蛋白復(fù)合物是骨骼肌中重要的骨架蛋白，是研究離心運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌細(xì)胞內(nèi)部變化的敏感指標(biāo)。目前對(duì)desmin在動(dòng)物和人體上的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了不一致的觀(guān)察結(jié)果，因此有關(guān)人體的這方面的研究還需進(jìn)一步深入。