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《遼寧體育科技》2013年第6期
劉建軍孫岳
遼寧省體育科學(xué)研究所遼寧沈陽110179
收稿日期：2013-07-03；修回日期：2013-12-06
作者簡介：劉建軍(1983-)，男，助理研究員，碩士，研究方向：運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)。
摘要：
目的：
采用大鼠下坡跑運(yùn)動(dòng)損傷模型，研究離心力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)刻大鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化，探討離心力竭運(yùn)動(dòng)所致骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷機(jī)制，為科學(xué)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練及運(yùn)動(dòng)恢復(fù)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
方法：
雄性SD大鼠60只隨機(jī)分為6組（每組10只）：安靜對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)后即刻組、12h組、24h組、48h組和72h組，以速度16m/min，坡度-16°進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)100min，休息5min，再運(yùn)動(dòng)100min，在不同時(shí)刻觀察大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化。
結(jié)果：
運(yùn)動(dòng)后即刻肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性與對(duì)照組相比顯著下降（P＜0.01），隨后開始恢復(fù)，運(yùn)動(dòng)后24h接近對(duì)照組水平（P＞0.05），運(yùn)動(dòng)后48h已完全恢復(fù)到對(duì)照組水平。
結(jié)論：
離心力竭運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性顯著下降，隨后逐漸恢復(fù)，運(yùn)動(dòng)后24h明顯恢復(fù)，至48h已完全恢復(fù)，肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化可以間接評(píng)定運(yùn)動(dòng)后骨骼肌的損傷。
肌漿網(wǎng)的蛋白質(zhì)中70％～90％為Ca2+-ATPase，即鈣泵蛋白。運(yùn)動(dòng)過程中，肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活力的降低將直接影響肌漿網(wǎng)Ca2+調(diào)節(jié)能力。Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能的變化不僅會(huì)直接影響肌肉收縮功能，而且會(huì)造成細(xì)胞漿中游離Ca2+濃度增加，后者可以通過激活蛋白水解酶和磷脂酶等造成肌纖維蛋白的降解，從而引起肌肉超微結(jié)構(gòu)的異常和收縮機(jī)能的下降，影響骨骼肌運(yùn)動(dòng)能力。有研究認(rèn)為Ca2+在運(yùn)動(dòng)性肌肉微損傷中起著重要的作用，可能是其產(chǎn)生的一個(gè)中樞機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用一次性力竭離心運(yùn)動(dòng)模型，通過研究一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠損傷特別嚴(yán)重的前肢肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化進(jìn)一步探討離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷的內(nèi)在機(jī)制，為制定科學(xué)合理的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案，防治運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練損傷提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法
1．1實(shí)驗(yàn)對(duì)象
成年雄性SD大鼠60只，體重(298．13±12．68)g。自然光照，室溫(22±3)℃、濕度(55±5)％，分籠飼養(yǎng)，自由飲食。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前均未進(jìn)行過跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。
1．2實(shí)驗(yàn)方法
1．2．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
篩選具有正常跑臺(tái)下坡跑能力的大鼠，根據(jù)體重隨機(jī)分為6組：安靜對(duì)照組(Con)、運(yùn)動(dòng)后即刻組(E0)、12h組(E12)、24h組(E24)、48h組(E48)和72h組(E72)，每組10只大鼠。
1．2．2力竭模型
實(shí)驗(yàn)前3天，所有大鼠進(jìn)行5min～10min跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，以熟悉跑臺(tái)，速度為(5～10)m/min，坡度為0°。實(shí)驗(yàn)時(shí)，所有運(yùn)動(dòng)組大鼠均在小動(dòng)物電動(dòng)跑臺(tái)上進(jìn)行持續(xù)性下坡跑運(yùn)動(dòng)，速度為16m/min，坡度為-16°，運(yùn)動(dòng)100min后，休息5min，然后再運(yùn)動(dòng)100min，總運(yùn)動(dòng)時(shí)間為200min。根據(jù)Bedford對(duì)大鼠不同運(yùn)動(dòng)方式與至大攝氧量消耗關(guān)系的研究，確定此運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相當(dāng)于至大攝氧量的70％～75％。運(yùn)動(dòng)中使用聲、光刺激或毛刷刺激大鼠尾部，驅(qū)使其運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，將動(dòng)物放回籠中，同樣條件飼養(yǎng)，直到處死。
1．2．3測試樣本的采集
取材時(shí)間分別在運(yùn)動(dòng)后即刻、12h、24h、48h、72h。大鼠在處死前，先稱取體重，通過腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉，麻醉劑量為(0．25～0．5)g/kg體重。隨后迅速取大鼠右側(cè)前肢肱三頭肌組織，放入冷生理鹽水中洗去浮血，剔除脂肪及結(jié)締組織，用濾紙吸干后，迅速放入液氮冷凍，然后再放入-80℃低溫冰箱儲(chǔ)存，留做肌漿網(wǎng)的制備。肌漿網(wǎng)的制備參照Carl方法進(jìn)行。
1．2．4肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性的測定
采用南京建成生物工程研究所提供的超微量ATP酶試劑盒，測試儀器為6010紫外可見分光光度計(jì)，具體測試方法見試劑盒說明書。
1．2．5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
使用SPSS13．0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±SD表示，各組間運(yùn)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行比較，以P<0．05為具有顯著性差異，以P<0．01為具有非常顯著性差異。
2結(jié)果
2．1力竭運(yùn)動(dòng)前后大鼠一般情況的對(duì)比觀察
安靜對(duì)照組大鼠表現(xiàn)為神態(tài)安靜，眼睛有神，活潑好動(dòng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)者捕捉的逃避反應(yīng)比較敏感。運(yùn)動(dòng)組大鼠起初在跑臺(tái)上進(jìn)行下坡跑運(yùn)動(dòng)時(shí)，都在跑道前邊跑，步態(tài)正常，跑速比較均勻；隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的增加，跑步姿勢(shì)發(fā)生了變化，四肢表現(xiàn)為無力，腹部與跑道面接觸，有的甚至出現(xiàn)臥位跑，并且逐漸向跑道后移動(dòng)，跑速不均勻；運(yùn)動(dòng)到近200min時(shí)，大鼠反應(yīng)更加遲鈍，腹部皮毛濕潤，四肢足部腫脹，所有大鼠都在跑道后部跑動(dòng)，跑速明顯不均勻，不能跟隨跑道皮帶的速度。運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，大鼠表現(xiàn)為神態(tài)倦怠，眼睛暗淡無光，伏地喘息，反應(yīng)遲鈍，幾乎沒有逃避反應(yīng)，根據(jù)大鼠力竭的標(biāo)準(zhǔn)，可以判斷大鼠已經(jīng)力竭。
2．2運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)刻大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化
由表1和圖1可見，安靜時(shí)大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性為(9．46±1．42)U/mgprot，力竭運(yùn)動(dòng)后即刻肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性明顯降低，為(5．41±1．46)U/mgprot，較運(yùn)動(dòng)前下降了42．81％(P<0．01)；運(yùn)動(dòng)后12h肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性為(7．61±1．38)U/mgprot，較運(yùn)動(dòng)前下降了19．56％(P<0．05)，比運(yùn)動(dòng)后即刻升高了40．67％(P<0．01)；運(yùn)動(dòng)后24h肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性為(8．51±1．16)U/mgprot，較運(yùn)動(dòng)前下降了10．04％(P>0．05)，比運(yùn)動(dòng)后即刻升高了57．30％(P<0．01)，與安靜組相比沒有顯著性差異；運(yùn)動(dòng)后48h與運(yùn)動(dòng)后72h肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性分別為(9．06±1．55)U/mgprot和(9．34±1．411)U/mgprot，與安靜對(duì)照組相比無顯著性差異，提示已恢復(fù)到正常值。
3分析與討論
3．1大鼠運(yùn)動(dòng)性骨骼肌微損傷模型的建立
在動(dòng)物模擬性實(shí)驗(yàn)研究中，建立或復(fù)制動(dòng)物模型是研究的重要環(huán)節(jié)，模型的適用性、可靠性和可行性直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性。
肌肉進(jìn)行高強(qiáng)度、大負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)容易引起骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，關(guān)于一次性離心力竭運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)刻大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化研究較少。運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的骨骼肌微損傷不僅與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和時(shí)間有關(guān)，而且與運(yùn)動(dòng)中骨骼肌的收縮方式有著密切的聯(lián)系。Armstrong RB等用大鼠模型研究了相同強(qiáng)度的離心收縮(下坡跑)和向心收縮(上坡跑)對(duì)骨骼肌損傷的不同效應(yīng)，通過組織學(xué)觀察以及有關(guān)的生物化學(xué)和組織化學(xué)指標(biāo)證實(shí)離心收縮相對(duì)向心收縮運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌的損傷更大。Newham等用肌肉活檢技術(shù)研究了上(向心收縮)、下(離心收縮)臺(tái)階運(yùn)動(dòng)后人體股四頭肌超微結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明，離心收縮運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的人體骨骼肌損傷程度明顯比向心收縮運(yùn)動(dòng)后的嚴(yán)重。McHugh MP等研究發(fā)現(xiàn)，離心收縮過程中產(chǎn)生單位力矩的EM(表面肌電圖)信號(hào)低于向心收縮。同時(shí)，Rall JA發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生相同力量的離心收縮所消耗的能量較相應(yīng)的向心收縮少。表明離心收縮時(shí)只有一小部分運(yùn)動(dòng)單位被選擇性地募集參與收縮過程，因此離心收縮時(shí)較大的力量就由較少的運(yùn)動(dòng)單位來承擔(dān)，從而導(dǎo)致每根肌纖維相對(duì)向心收縮承受更大的張力。因此，目前多數(shù)研究者認(rèn)為，離心收縮中骨骼肌纖維承受較大的張力可能會(huì)導(dǎo)致肌纖維和支持它們的結(jié)締組織的機(jī)械損傷。
大鼠在下坡跑運(yùn)動(dòng)中，肌肉抵抗體質(zhì)量形成的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷進(jìn)行離心收縮做功。大鼠主要的工作肌肉是前肢肌肉，而對(duì)其后肢，由于體質(zhì)量的分布原因，作用效果相對(duì)較小。因此本實(shí)驗(yàn)選取了大鼠前肢的肱三頭肌作為主要研究的肌肉。
3．2離心力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的影響
肌漿網(wǎng)是骨骼肌細(xì)胞內(nèi)一種重要的鈣貯存器，在哺乳動(dòng)物骨骼肌的Ca2+調(diào)節(jié)中起主要的作用。有研究表明，Ca2+濃度升高的90％是由肌漿網(wǎng)釋放的，而舒張期胞漿內(nèi)Ca2+濃度降低的70％～75％也是由肌漿網(wǎng)攝取并貯存在肌漿網(wǎng)內(nèi)的。肌漿網(wǎng)通過Ca2+的攝取和釋放參與細(xì)胞漿中Ca2+濃度的調(diào)節(jié)，在興奮-收縮偶聯(lián)中起關(guān)鍵作用。盡管骨骼肌損傷是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，但是肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+攝取功能的改變是其一個(gè)重要的原因，并且在骨骼肌疲勞及損傷的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的生理功能。
在肌肉重復(fù)性收縮過程中，由于某些因素使肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性降低，肌漿網(wǎng)鈣代謝功能異常，影響肌漿網(wǎng)鈣泵系統(tǒng)將胞漿中游離的多余Ca2+攝入肌漿網(wǎng)中，使運(yùn)輸回肌漿網(wǎng)的Ca2+量減少、速度減慢，并造成細(xì)胞漿中游離Ca2+濃度增加，使肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白形成的橫橋分離速度減慢，肌肉無法維持反復(fù)性的收縮，結(jié)果因?yàn)镃a2+濃度的干擾延長了肌肉放松的時(shí)間，導(dǎo)致骨骼肌肌纖維的損傷。Byld以馬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究高強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)肌漿網(wǎng)功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后即刻臀肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性有所下降。田野讓大鼠在零坡度，以18m/min的速度在跑臺(tái)上持續(xù)跑100min力竭，運(yùn)動(dòng)后即刻發(fā)現(xiàn)大鼠股四頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性有明顯變化，較運(yùn)動(dòng)前下降了18．74％。李潔讓大鼠以同樣的方式運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)腓腸肌和比目魚肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性都比對(duì)照組有顯著性下降。王翔等讓大鼠在坡度為零的跑臺(tái)上運(yùn)動(dòng)至力竭，發(fā)現(xiàn)大鼠紅肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性顯著地降低(P<0．05)，白肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性非常顯著地降低(P<0．01)。Yasuda等觀察了大鼠在中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度兩種運(yùn)動(dòng)負(fù)荷情況下比目魚肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase的變化，結(jié)果顯示兩種負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后即刻肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase的活性均顯著性下降。
在本研究中，運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性比安靜時(shí)下降了42．81％(P<0．01)，提示長時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)后肌漿網(wǎng)功能有所下降，Ca2+調(diào)節(jié)能力減弱，與許多研究結(jié)果相同。運(yùn)動(dòng)后12h大鼠肱三頭肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性比安靜時(shí)下降了19．56％(P<0．05)，比運(yùn)動(dòng)后即刻升高了40．67％(P<0．01)，說明肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性開始恢復(fù)，運(yùn)動(dòng)后24h肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶活性較運(yùn)動(dòng)前下降了10．04％(P>0．05)，比運(yùn)動(dòng)后即刻升高了57．30％(P<0．01)，與安靜組相比沒有顯著性差異，肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性接近安靜組水平；運(yùn)動(dòng)后48h與72h肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性與安靜組相比沒有顯著性差異，已完全恢復(fù)到正常值。
肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的下降必然會(huì)影響肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+的攝取。李潔的研究結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)后腓腸肌肌漿網(wǎng)的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)速率下降了47．94％。魏源等讓大鼠在跑臺(tái)上零坡度運(yùn)動(dòng)至力竭，運(yùn)動(dòng)后肌漿網(wǎng)Ca2+攝取率較運(yùn)動(dòng)前下降了17．72％(P<0．01)。James A讓受試者在功率自行車上以75％至大攝氧量持續(xù)運(yùn)動(dòng)直到疲勞，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后肌漿網(wǎng)Ca2+攝取率下降了25％。J．D．Schemer等讓大鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，研究結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+攝取率比安靜組有明顯的降低。
從以上研究結(jié)果可以看出，在長時(shí)間力竭性運(yùn)動(dòng)后即刻肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性顯著下降，Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)能發(fā)生了變化，使胞漿內(nèi)Ca2+濃度增高，造成骨骼肌收縮機(jī)能下降，引起肌肉疲勞甚至損傷。因此，肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性的變化可以間接評(píng)定運(yùn)動(dòng)后骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的損傷。
4結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)采用的離心力竭跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)，使大鼠產(chǎn)生力竭。運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性顯著下降，隨后逐漸恢復(fù)，24h后明顯恢復(fù)，至48h已完全恢復(fù)。提示肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶活性的變化可以作為評(píng)定運(yùn)動(dòng)后骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷的一個(gè)指標(biāo)。