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作者:秦瑞峰顧曉明秦曉春
《第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報》2001年01期
【作者單位】:第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院頜面外科!陜西西安710033
第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院頜面外科!陜西西安710033
黑龍江省龍江廣厚醫(yī)院
摘要:
目的:
對骨骼肌分化中的凋亡現(xiàn)象進(jìn)行初步研究。
方法:
本實驗采用體外培養(yǎng)的C2C12肌母細(xì)胞分化模型,用流式細(xì)胞儀檢測肌細(xì)胞分化過程中細(xì)胞周期的變化,提取細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行電泳分析,用原位末端標(biāo)記法進(jìn)行了凋亡細(xì)胞染色,電子顯微鏡觀察凋亡小體的形成。
結(jié)果:
C2C12細(xì)胞在肌分化誘導(dǎo)24h和48h,檢測出凋亡現(xiàn)象;而對照組、肌分化誘導(dǎo)72h組均未檢出凋亡現(xiàn)象。
結(jié)論:
在肌肉分化、發(fā)育的過程中,某些細(xì)胞會按自身程序主動死亡,以凋亡細(xì)胞的形式排除,而且具有明顯的時間性,終末分化的肌管不易出現(xiàn)凋亡。
0引言
細(xì)胞凋亡近年來已成為細(xì)胞生物學(xué)研究的新領(lǐng)域,它作為一種細(xì)胞生理性的死亡方式,在維護機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用。凋亡現(xiàn)象的研究方法很多,形態(tài)上表現(xiàn)為細(xì)胞固縮、染色體凝集并向核膜靠攏,終形成新月狀小體;其生化學(xué)特征則是DNA在核酸電泳時呈梯級格局。凋亡概念的提出為研究胚胎發(fā)生、發(fā)展、個體形成、器官的細(xì)胞平衡增添了新的內(nèi)容,指導(dǎo)醫(yī)學(xué)實踐。骨骼肌肌母細(xì)胞分化發(fā)育,先必須退出細(xì)胞增殖周期,在多種因子的調(diào)節(jié)下,融合成具有多核的肌管結(jié)構(gòu)。C2C12是小鼠骨骼肌肌母細(xì)胞,20mL·L-1胚牛血清的DMEM培養(yǎng)基可誘導(dǎo)其分化,且骨骼肌細(xì)胞分化過程中DNA的合成以及細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化。我們采用C2C12細(xì)胞模型,對骨骼肌分化中的凋亡現(xiàn)象進(jìn)行初步研究,以闡述機體骨骼肌發(fā)生、發(fā)育中肌細(xì)胞的凋亡作用,從而為進(jìn)一步研究骨骼肌損傷后再生的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。
1材料和方法
1.1材料
C2C12細(xì)胞(澳大利Proton教授惠贈),調(diào)整細(xì)胞密度至5×105·L-1,接種于100mL·L-1胚牛血清的DMEM(Hyclone)培養(yǎng)基中,在50mL·L-1 CO2孵育箱培養(yǎng)(37℃)。培養(yǎng)至對數(shù)期細(xì)胞隨機分為對照組和實驗組,對照組為生長培養(yǎng)基GM(100mL·L-1胚牛血清的DMEM),實驗組改變?yōu)榉只囵B(yǎng)基DM(20mL·L-1胚牛血清的DMEM),分別24、48和72h換為分化培養(yǎng)基的進(jìn)行實驗。
1.2方法
1.2.1流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的檢測
按文獻(xiàn),分別取4組細(xì)胞試驗,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106mL-1,4℃PBS洗滌,700mL·L-1冷乙醇固定,上機前PBS洗滌細(xì)胞,加50μg mL-1碘化丙啶,1mL·L-1Triton X-100,0.1mmol·L-1EDTA(Na)2,50μg mL-1Rnase,4℃染色30min樣品300目尼龍膜過濾,488nm氬激光激發(fā),>610nm濾色片檢測,對細(xì)胞進(jìn)行分析。
1.2.2 TUNEL法
按原位細(xì)胞凋亡檢測盒(德國寶靈曼)程序進(jìn)行。常規(guī)細(xì)胞爬片,20μg·mL-1蛋白酶K消化30min,洗3遍,滴加TUNEL反應(yīng)液,37℃,60min,振洗后加入convert-AP,37℃,60min,之后滴加底物顯色液,10min終止反應(yīng),封片,光鏡下分析。凋亡細(xì)胞的胞核呈現(xiàn)紫藍(lán)色,未凋亡細(xì)胞的胞核不著色。
1.2.3電鏡檢測
常規(guī)方法制作透射電鏡標(biāo)本,用TEM-200EX透射電鏡觀察。
1.2.4 DNA的電泳分析
細(xì)胞經(jīng)2.5g·L-1胰酶消化,800min,離心5min收集細(xì)胞,48h漂浮細(xì)胞直接從培養(yǎng)液中離心收集。隨之提取各組細(xì)胞基因組DNA做電泳分析,在50V,30mA下,用20g·L-1瓊脂糖電泳2h,EB染色30min,紫外燈下觀察、拍照記錄。
2結(jié)果
2.1肌細(xì)胞分化過程中細(xì)胞周期
C2C12肌細(xì)胞分化培養(yǎng)基培養(yǎng)48h的細(xì)胞周期分析中,可見凋亡峰,在圖中位于單倍體和二倍體峰之間(Fig1)。
2.2形態(tài)學(xué)觀察和TUNEL法染色
光鏡下觀察,C2C12肌細(xì)胞GM培養(yǎng)24h可見少量凋亡細(xì)胞,胞核呈紫藍(lán)色,GM誘導(dǎo)48h凋亡細(xì)胞數(shù)量增多,存活細(xì)胞部分開始融合。對照組、GM誘導(dǎo)培養(yǎng)72h組均未見凋亡細(xì)胞,后者肌細(xì)胞融合形成的肌管增多,肌管內(nèi)含多個胞核的分化現(xiàn)象(Fig2)。
2.3電鏡觀察
GM誘導(dǎo)培養(yǎng)24h和48h的C2C12肌細(xì)胞中,出現(xiàn)凋亡細(xì)胞,凋亡細(xì)胞核漿比例增大,核片段聚集成塊堆聚在核膜周圍(Fig3)。
2.4細(xì)胞基因組DNA的電泳分析
肌細(xì)胞于分化培養(yǎng)基培養(yǎng)24h、細(xì)胞出現(xiàn)梯狀DNA,尤以48h懸浮細(xì)胞顯著(Fig4)。
3討論
迄今已發(fā)現(xiàn)許多因素都可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,生化機制還不十分明確。一般認(rèn)為程序化細(xì)胞死亡過程中核DNA的降解是由于一種Ca2+,Mg2+依賴性內(nèi)切酶活化引起的。多細(xì)胞有機體的發(fā)生、發(fā)育有賴于細(xì)胞增殖、分化和死亡的精密結(jié)合,即細(xì)胞周期的正常運行,細(xì)胞的增殖和凋亡的平衡。對肌肉細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的研究將對揭示肌細(xì)胞惡變、老化、退變性肌病等的發(fā)病機制及其治療有重要意義。
FCM是檢測細(xì)胞凋亡有效而靈敏的方法,為觀察凋亡提供了新的手段;凋亡細(xì)胞檢測技術(shù)TUNEL法,是利用凋亡細(xì)胞生化特征的先進(jìn)檢測技術(shù),具有很高的靈敏性。本實驗中肌細(xì)胞分化的特定時期即肌母細(xì)胞在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)24h和48h,TUNEL法染出了凋亡細(xì)胞,此外,DNA凝膠電泳分析出現(xiàn)反映核小體斷裂的DNA梯狀帶。以上結(jié)果表明,在肌肉分化、發(fā)育的過程中,某些細(xì)胞會按自身程序主動死亡,以凋亡細(xì)胞的形式排除,這在肌肉組織重建有積極的意義。另外,凋亡的發(fā)生具有明顯的時間性,分化早期(24h)檢測出凋亡細(xì)胞數(shù)量較少,可能原因是此期間為特異性基因開放期,分子水平反映活躍,形態(tài)改變不太顯著;分化后期(72h)不再發(fā)生凋亡,主要原因在于誘導(dǎo)72h后肌母細(xì)胞已經(jīng)融合形成肌管,肌管是終末分化的肌細(xì)胞,不能再進(jìn)入細(xì)胞分裂周期。不過,近期有的學(xué)者SV40大抗原引入肌管,終末分化的肌管重新進(jìn)入細(xì)胞周期,出現(xiàn)減數(shù)分裂和凋亡,說明肌管仍具有凋亡發(fā)生的機制。
細(xì)胞凋亡時伴有多種基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。c-myc是調(diào)控細(xì)胞增殖的主要基因,c-myc的表達(dá)產(chǎn)物是一種轉(zhuǎn)錄因子,與細(xì)胞增殖分化及癌變有密切關(guān)系。Evan等選用大鼠成纖維細(xì)胞Rat1/myc為實驗?zāi)P脱芯堪l(fā)現(xiàn),當(dāng)有某些因素(低血清濃度,抑制細(xì)胞周期因子,抑癌基因)存在時c-myc基因的表達(dá)與細(xì)胞程序性死亡密切相關(guān)。本實驗在誘導(dǎo)肌細(xì)胞分化時采用20mL·L-1血清的DMEM培養(yǎng)基,c-myc可能在細(xì)胞的凋亡方面起了很重要作用,c-myc的調(diào)節(jié)過程的機制仍很不清楚??傊?,肌母細(xì)胞分化、發(fā)育的過程中出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象可能為保證肌肉發(fā)育成熟所必須,為清除不再需要的肌細(xì)胞提供了一個有效機制,它的研究對于肌肉系統(tǒng)疾病認(rèn)識將有很大幫助。