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劉曉蓉1，謝有梅2，張成1，王展航1，張為西1，盧錫林1，蘇全喜3
收稿日期：2001-09-08；修訂日期：2001-12-27
摘要：
目的：
研究mdx鼠體內(nèi)骨骼肌細(xì)胞凋亡情況，探討凋亡對(duì)Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)的發(fā)生發(fā)展所起的作用。
方法：
采用流式細(xì)胞儀碘化丙啶(PI)排斥法測(cè)定不同滲透壓下成肌細(xì)胞的凋亡數(shù)目，用TUNEL法測(cè)定不同鼠齡的mdx鼠骨骼肌細(xì)胞的凋亡情況。
結(jié)果：
mdx鼠的成肌細(xì)胞在外界滲透壓變化的情況下，發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)較C57鼠明顯增加，且隨mdx鼠鼠齡的增長(zhǎng)而增加。
結(jié)論：
抗肌萎縮蛋白(dys)的缺失引起的凋亡在DMD疾病的啟動(dòng)和病程進(jìn)展中可能起重要作用。
關(guān)鍵詞：mdx鼠；凋亡；抗肌萎縮蛋白
Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)是常見(jiàn)的X連鎖隱性遺傳病。3～4歲起病，以進(jìn)行性四肢骨骼肌萎縮無(wú)力伴小腿腓腸肌假性肥大為特征，同時(shí)累及心肌和呼吸肌，多于未成年死亡，病因是位于Xp21的抗肌萎縮蛋白(dys)基因突變引起細(xì)胞骨架蛋白dys缺失。以往人們認(rèn)為dys的缺失主要引起骨骼肌細(xì)胞的變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但近來(lái)逐漸發(fā)現(xiàn)凋亡在骨骼肌萎縮性疾病中起著重要作用。本文通過(guò)對(duì)DMD動(dòng)物模型mdx鼠的骨骼肌凋亡情況的研究，探討凋亡在DMD發(fā)病過(guò)程中的作用。
1材料與方法
1．1實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組
實(shí)驗(yàn)共分兩組：
對(duì)照組：出生3d以內(nèi)的C57乳鼠15只，4～8周的C57鼠8只；
實(shí)驗(yàn)組：出生3d以內(nèi)的mdx鼠15只，1個(gè)月的mdx鼠，3個(gè)月的mdx鼠、6個(gè)月的mdx鼠各8只。
C57鼠購(gòu)自中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，mdx鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室。所有動(dòng)物為二級(jí)以上動(dòng)物，雌雄不限，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。
1．2成肌細(xì)胞的培養(yǎng)，鑒定和流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡
取出生3d以內(nèi)的C57和mdx乳鼠引頸法處死，去皮后取四肢的骨骼肌各分6瓶進(jìn)行成肌細(xì)胞培養(yǎng)，用差速貼壁法進(jìn)行純化，純化后的細(xì)胞以1×105/ml的密度分別接種于75ml的培養(yǎng)瓶里，分別加入高滲透壓培養(yǎng)液(普通高糖DMEM培養(yǎng)基中加入等體積的50％的葡萄糖溶液)，正常滲透壓培養(yǎng)液(普通高糖DMEM)、低滲透壓培養(yǎng)液(普通高糖DMEM培養(yǎng)基中加入等體積的無(wú)菌三蒸水)，在5％CO2，37℃的條件下松口培養(yǎng)。7d后胰酶消化，0．4％的臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞存活比例，用SP免疫組化法進(jìn)行Desmin染色，DAB顯色。另外，用流式細(xì)胞儀碘化丙啶(PI)排斥法進(jìn)行凋亡檢測(cè)，計(jì)算凋亡細(xì)胞的比例。
1．3成年鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)
引頸法處死C57鼠和mdx鼠，取四肢肌肉，OCT包埋，冷凍切片，丙酮固定。采用TUNEL法染色，BCIP/NBT顯色，甲基綠復(fù)染正常胞核，伊紅襯染胞漿。100倍放大倍數(shù)下隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行圖像分析，計(jì)數(shù)凋亡核和正常細(xì)胞核數(shù)目，按如下公式計(jì)算凋亡核占總細(xì)胞核數(shù)的比例。凋亡核比例＝凋亡細(xì)胞核數(shù)/(凋亡核+正常細(xì)胞核)
1．4試劑與儀器
DMEM培養(yǎng)基(Gibcol)、胎牛血清(杭州四季青公司)、ELITE型流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)、冷凍切片機(jī)(Leka CM1850型，，SP免疫組化檢測(cè)試劑盒(福州邁新試劑公司)、細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(Roche)、兔抗鼠desmin抗體(博士德公司)、IBAS 2．5全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)KONTRON)、Ky-F30B 3-CCD彩色圖像搔錄輸入儀(日本JVC)。
1．5統(tǒng)計(jì)方法
采用組間t檢驗(yàn)。
2結(jié)果
2．1成肌細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定
C57鼠和mdx鼠的成肌細(xì)胞培養(yǎng)7d時(shí)已鋪滿培養(yǎng)瓶底，細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭形，體積大小較均一。兩組細(xì)胞在生長(zhǎng)速度和形態(tài)上無(wú)明顯差別。經(jīng)過(guò)胰酶消化、臺(tái)盼藍(lán)染色后，兩組成肌細(xì)胞存活率均在99％以上。將細(xì)胞涂片進(jìn)行Desmin染色后可見(jiàn)：為梭形、多核細(xì)胞。胞漿被染成棕黃色，胞核不染色或被染成淡黃色，證明此種細(xì)胞具有Desmin的形成，是成肌細(xì)胞，兩組細(xì)胞的形態(tài)及染色結(jié)果無(wú)明顯差別。
2．2成肌細(xì)胞的凋亡
PI排斥法計(jì)數(shù)1．2×105個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占的比例，在正常滲透壓下，mdx鼠的成肌細(xì)胞凋亡數(shù)與C57鼠相差不明顯，分別為1．2％和1．1％，且G2期、M期細(xì)胞較多，細(xì)胞增殖明顯，但在低滲的情況下，C57鼠細(xì)胞的凋亡效無(wú)明顯增加(0．6％)，而mdx鼠的成肌細(xì)胞凋亡數(shù)目增加了一倍(2．5％)；在高滲的情況下，C57鼠的凋亡數(shù)目明顯增加(8．6％)，但mdx鼠凋亡細(xì)胞增加的程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了C57鼠，達(dá)到了10．8％。說(shuō)明mdx鼠的成肌細(xì)胞在細(xì)胞外滲透壓變化時(shí)，凋亡數(shù)目明顯增加；而G0期、G1期細(xì)胞數(shù)目變化不明顯，G2期、M期細(xì)胞減少，細(xì)胞增殖減少。
2．3成年鼠的骨骼肌細(xì)胞凋亡情況
用TUNEL法險(xiǎn)測(cè)骨骼肌細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)生凋亡的細(xì)胞校被染成藍(lán)紫色，而正常細(xì)胞核呈綠色，胞漿呈淡紅色，結(jié)果顯示：C57鼠正常情況下幾乎無(wú)凋亡細(xì)胞，而mdx鼠的骨骼肌細(xì)胞的凋亡數(shù)目明顯高于C57鼠，凋亡細(xì)胞核和胞漿固縮、變形，與鄰周細(xì)胞脫離，凋亡小體形成，且大部分凋亡細(xì)胞核主要位于細(xì)胞間質(zhì)。圖像分析顯示：凋亡隨著鼠齡的增長(zhǎng)而增加，C57鼠、1個(gè)月的mdx鼠、3個(gè)月的mdx鼠、6個(gè)月的mdx鼠的凋亡細(xì)胞核比例分別為2％、5％、25％、42％。各組之間比較差異顯著(P<0．05)。
3討論
本研究中所使用的mdx鼠，是X染色體上dys基因的23號(hào)外顯子(dys23)發(fā)生單個(gè)堿基替代，而引起點(diǎn)突變，導(dǎo)致dys缺乏，具有與DMD患者相似的發(fā)病分子基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)多項(xiàng)研究已證明其具有DMD疾病變化的典型的變性、壞死的病理基礎(chǔ)，是一種研究DMD疾病的理想的動(dòng)物模型，所以，用mdx鼠來(lái)研究DMD的凋亡情況是合理的。
目前人們通過(guò)對(duì)DMD患者的病理研究確認(rèn)了該病骨骼肌的變性、壞死明顯增多，但對(duì)壞死是如何啟動(dòng)的知之甚少。同時(shí)，人們雖對(duì)凋亡本身的啟動(dòng)及發(fā)生演變機(jī)制有了一定了解，但對(duì)于骨骼肌中凋亡的研究卻起步晚、認(rèn)識(shí)少，1995年Rodrigues等在電鏡下觀察到去神經(jīng)比目魚(yú)肌出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變后，人們才對(duì)凋亡在肌病中所起的作用引起重視。1995年Matsuda等初次提供了DMD的肌纖維中存在凋亡的證據(jù)，從而引發(fā)了人們對(duì)DMD中凋亡的研究，本研究結(jié)果證明dys的缺乏可以引起肌細(xì)胞的凋亡數(shù)目增加。
一方面，凋亡肌細(xì)胞的增加與細(xì)胞滲透壓變化有關(guān)。在成肌細(xì)胞階段，C57鼠和mdx鼠只有少部分細(xì)胞凋亡，可能是維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)和循環(huán)的一部分。在細(xì)胞外滲透壓改變時(shí)，mdx鼠的凋亡細(xì)胞數(shù)較C57鼠明顯升高，說(shuō)明dys的缺乏可引起肌細(xì)胞膜通透性增加，使mdx鼠的成肌細(xì)胞對(duì)外界滲透壓變化更加敏感，從而誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞數(shù)目增多。也說(shuō)明dys的缺乏對(duì)成肌細(xì)胞階段的細(xì)胞生理就已經(jīng)產(chǎn)生了一定影響，使細(xì)胞在外界環(huán)境變化時(shí)更加脆弱。另一方面，凋亡隨年齡的增長(zhǎng)而增加，C57成年鼠的細(xì)胞凋亡數(shù)目較成肌細(xì)胞階段無(wú)明顯升高，面對(duì)于mdx鼠，凋亡細(xì)胞數(shù)目隨著鼠齡的增加而逐漸增加，且較C57鼠肌細(xì)胞的凋亡數(shù)目明顯增多。這與Sandri等的研究結(jié)果一致。
由以上推斷，DMD的疾病進(jìn)展可能與肌細(xì)胞凋亡的增加有重要關(guān)系：一方面，凋亡的變化過(guò)程與DMD疾病的病程相一致，DMD雖是遺傳性疾病，但DMD患者在起初的3～4年間發(fā)育正常、無(wú)癥狀，而此時(shí)骨骼肌細(xì)胞的凋亡數(shù)目少，凋亡只是維持正常生長(zhǎng)代謝的一部分。但是，隨著年齡的增長(zhǎng)，肌細(xì)胞中的凋亡逐漸增加，患者癥狀出現(xiàn)并逐漸加重，在mdx鼠6個(gè)月時(shí)(相當(dāng)于患者的20歲左右)，凋亡細(xì)胞數(shù)已達(dá)40％之多。有研究證明在體外誘發(fā)肌細(xì)胞凋亡后的8h內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)CPK活性逐漸喪失至不可檢測(cè)的水平。說(shuō)明凋亡的啟動(dòng)導(dǎo)致了肌細(xì)胞內(nèi)肌酶的滅活或泄露。CPK、CK-MB在疾病早期、肌壞死出現(xiàn)之前就已出現(xiàn)，很可能是細(xì)胞發(fā)生凋亡所致。Mikhailov等多人的研究也證明，在運(yùn)動(dòng)后，mdx鼠的肌細(xì)胞凋亡明顯增加，推斷DMD患者之所以在3～4歲才出現(xiàn)癥狀可能與這一時(shí)期患者的活動(dòng)增加、肌肉負(fù)荷增加而誘導(dǎo)的凋亡增加有關(guān)。所以，凋亡的啟動(dòng)可能是疾病發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，是繼發(fā)引起肌細(xì)胞變性、壞死的重要原因，另一方面，肌間質(zhì)細(xì)胞凋亡的增加導(dǎo)致肌細(xì)胞再生困難。凋亡細(xì)胞主要位于肌間質(zhì)，而成人或成年鼠的肌細(xì)胞再生主要依靠存在于間質(zhì)的肌衛(wèi)星細(xì)胞，其凋亡使衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)目減少，病損肌肉的再生和修復(fù)受到影響，繼發(fā)性引起正常肌細(xì)胞數(shù)目減少，從而使疾病呈進(jìn)行性發(fā)展。
目前對(duì)于dys的缺失如何引起凋亡的機(jī)制尚不清楚。筆者認(rèn)為可能有以下幾種原因：
(1)Ca2+通道異常：DMD患者肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+顯著增加，肌膜Ca2+-ATPase活性增加，使細(xì)胞鈣超載，引起胞內(nèi)溶酶體酶釋放而造成凋亡。鈣超載可能是引起凋亡的主要原因。
(2)膜不穩(wěn)定：dys與dys復(fù)合物構(gòu)成一個(gè)跨膜連接體，dys的缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞骨架的不完整，時(shí)各種離子、蛋白的通透性增加，后者導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)滲透壓的變化有可能對(duì)凋亡的發(fā)生有一定作用，但具體機(jī)制尚待闡述。
(3)與炎癥相關(guān)：炎細(xì)胞浸潤(rùn)在DMD肌肉中是常見(jiàn)現(xiàn)象。Spencer等發(fā)現(xiàn)：在運(yùn)動(dòng)后，mdx鼠的肌肉CTL和輔助T細(xì)胞浸潤(rùn)增加，同時(shí)炎癥相關(guān)蛋白Perforin表達(dá)濃度升高。在dys基因和perforin基因雙敲除的動(dòng)物模型中，幾乎役有凋亡發(fā)生，認(rèn)為：CTL介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對(duì)mdx鼠的肌纖維的凋亡和壞死有重要作用，pertorin可能是凋亡的起初啟動(dòng)因素。
(4)NO因素：有人發(fā)現(xiàn)dys缺失導(dǎo)致肌肉相關(guān)蛋白的表達(dá)量異常，其中腦型一氧化氮合酶(nNOS)的表達(dá)及在膜上分布明顯減少，膜結(jié)合NOS活性降低，NO在肌纖維內(nèi)明顯增多，而NO可誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。以上均是對(duì)mdx鼠和DMD患者肌細(xì)胞凋亡的可能解釋，其具體發(fā)生機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。
總之，dys的缺乏可引起肌細(xì)胞的凋亡數(shù)目增加，且凋亡對(duì)于DMD的發(fā)病和病情進(jìn)展起著一定的作用，可能是引起DMD發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)和貫穿病程的重要影響因素。