相關(guān)論壇
黃益民，趙輝，虞欣，鐘偉，郭金良，孫素琴，李勇，公衍道，丁小蘭
北京心肺血管疾病研究所血液流變學(xué)研究室，北京100029；
清華大學(xué)分析中心，北京100084；
清華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)系，北京100084
摘要：
為探明自由基對(duì)紅細(xì)胞膜脂質(zhì)及蛋白分子損傷機(jī)理，本文通過(guò)電子自旋共振波譜儀（ESR）、激光拉曼波譜儀、圓二色波譜儀（CD）、顯微付立葉變換紅外波譜儀（MFT-IR）和表面電子能譜分析系統(tǒng)（ESCA）分別對(duì)體外自由基作用30分鐘后，及作用后3小時(shí)紅細(xì)胞膜整體結(jié)構(gòu)、膜蛋白分子及脂質(zhì)分子進(jìn)行了分析。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自由基作用后：
①紅細(xì)胞膜中β-胡蘿卜素構(gòu)象由伸展變?yōu)榫砬?，提示膜整體結(jié)構(gòu)改變；
②膜蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，表現(xiàn)為α螺旋減少和β折疊增加；
③膜蛋白分子二硫鍵與巰基的比例增加（S-S/SH）、亞氨基（NH）和羰基含量改變，同時(shí)蛋白分子的氫鍵也被破壞（如NH、COH等基團(tuán)的減少和VC、CO的增加）；
④膜脂分子磷氧雙鍵（P=O）成分、羰基成分（C=O）、碳-碳雙鍵（C=C）成分降低；說(shuō)明自由基導(dǎo)致紅細(xì)胞膜蛋白及脂質(zhì)分子化學(xué)結(jié)構(gòu)改變是造成膜分子構(gòu)象及膜整體結(jié)構(gòu)改變的根本原因。
3小時(shí)后無(wú)論是膜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、二硫鍵與巰基比或膜脂分子P=O、C=O、C=C不僅沒(méi)有恢復(fù)，反而有加重趨勢(shì)。這說(shuō)明了自由基損傷的部分不可逆性。
紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性是紅細(xì)胞順利通過(guò)毛細(xì)血管完成與組織氧交換的重要保證。紅細(xì)胞膜是由磷脂雙層(外層主要為磷脂酰膽堿和神經(jīng)鞘磷脂與膽固醇形成互補(bǔ)作用，內(nèi)層主要為磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲胺酸與膽固醇反互補(bǔ))、鑲嵌蛋白及支撐于膜內(nèi)側(cè)的膜骨架蛋白構(gòu)成。膜脂分子在脂雙層結(jié)構(gòu)中是不對(duì)稱性分布的，同時(shí)它們還不停地進(jìn)行著軸旋轉(zhuǎn)、烴鏈的擺動(dòng)及同層水平擴(kuò)散等三種主要運(yùn)動(dòng)；而一些膜蛋白如一些受體、一些酶和一些通道等同樣也不停的旋轉(zhuǎn)和在脂雙層中擴(kuò)散；這種分子運(yùn)動(dòng)不僅是紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的基礎(chǔ)，同時(shí)也是這些分子發(fā)揮功能的必要條件。成熟紅細(xì)胞外層的多不飽和酰磷脂烴鏈中的碳-碳雙鍵的鍵角度使外層磷脂分子排列無(wú)序、疏松，分子間作用力較弱，流動(dòng)性較大，而內(nèi)層分子主要是飽和酰磷脂，有序性強(qiáng)，流動(dòng)性較小。膜蛋白(骨架蛋白、受體、酶、抗原等)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α螺旋伸入到膜脂雙層中，其螺旋外側(cè)的疏水基團(tuán)與脂雙層疏水區(qū)的烴鏈形成疏水鍵，而二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β折疊多是鋪于膜表面與磷脂形成疏水和靜力作用，穩(wěn)定及調(diào)節(jié)膜脂雙層的不對(duì)稱分布及流動(dòng)性。膜脂分子及蛋白分子的流動(dòng)性受著分子結(jié)構(gòu)及相互作用關(guān)系的影響并終會(huì)影響整體膜的流動(dòng)性。膜骨架是由多種蛋白相互連結(jié)而形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其蛋白成分不具有獨(dú)立的及隨機(jī)的運(yùn)動(dòng)；除支撐作用外，通過(guò)其部分蛋白嵌入膜脂雙層而達(dá)到穩(wěn)定及調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性的作用。膜骨架是紅細(xì)胞膜彈性的主要決定因素。同樣某些因素引起其分子結(jié)構(gòu)改變終將會(huì)影響整個(gè)細(xì)胞的彈性。
自由基是含有不配對(duì)電子的高活性物質(zhì)，它通過(guò)電子傳遞而與其它分子發(fā)生氧化-還原反應(yīng)。自由基是自然存在的并是許多生理過(guò)程所需的，但當(dāng)其產(chǎn)生過(guò)量或出現(xiàn)在不適當(dāng)?shù)募?xì)胞部位將通過(guò)過(guò)氧化反應(yīng)而導(dǎo)致分子的結(jié)構(gòu)及功能的破壞后面造成細(xì)胞、組織的病理改變。前期的研究已證明自由基特別是以氧為中心的自由基通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化而引起膜脂分子結(jié)構(gòu)的改變，表現(xiàn)為烴鏈碳-碳雙鍵的減少和游離脂肪酸的釋放，此外自由基對(duì)蛋白分子的攻擊可造成蛋白分子結(jié)構(gòu)及功能的改變。這些分子結(jié)構(gòu)的改變將影響其流動(dòng)性。A．M，Phelar報(bào)導(dǎo)了在腦缺血/再灌注期間腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)流動(dòng)性明顯降低，認(rèn)為與此期間產(chǎn)生的自由基損傷有關(guān)。紅細(xì)胞由于有一個(gè)高氧含量并與氧反復(fù)混合，膜含有大量的高活性碳-碳雙鍵的多不飽和脂肪酸，血紅蛋白可提供催化產(chǎn)生損傷性自由基的鐵離子而對(duì)過(guò)氧化損傷尤其敏感。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，人紅細(xì)胞于體外與Fenton自由基體系作用30分鐘后，不僅引起細(xì)胞膜剪切彈性模量(the shear elasticmodulus of membrane)明顯增加，同時(shí)還引起膜脂質(zhì)及蛋白分子流動(dòng)性明顯下降，3小時(shí)后，只有脂質(zhì)分子的流動(dòng)性回復(fù)正常，而蛋白分子流動(dòng)性及膜的彈性模量只是部分回復(fù)。為探討自由基引起的紅細(xì)胞膜脂質(zhì)及蛋白分子結(jié)構(gòu)變化特征與這些分子流動(dòng)性改變間的關(guān)系，本文利用電子自旋共振、激光拉曼、顯微付立葉變換紅外、圓二色及電子能譜化學(xué)分析系統(tǒng)等技術(shù)對(duì)體外自由基作用前后紅細(xì)胞膜脂質(zhì)及蛋白分子構(gòu)象及化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)行了分析研究。
1材料及方法
1．1自由基體系：
按照下列方法配制高、低濃度的Haber Weiss(Fenton)羥自由基體系。高濃度按1：1：1的容積比將3％的H2O2、450μmol/L的FeSO4和2．7％的NaCl混合制成等滲、pH7．0的羥自由基體系；低濃度按0．5：1：1．5的容積比將3％的H2O2、450μmol/L的FeSO4和1．8％的NaCl混合制成等滲中H7．0的羥自由基體系。分別在以上體系配制后的即刻、十分鐘、三十分鐘和一小時(shí)用自旋捕捉劑DMPO(5，5-DIMETHYL-1-PYROLINEN-OXIDE)捕捉自由基，并于室溫條件下用電子自旋共振波譜儀(ESR Bruker ER-200D)在微波功率SP=10mW(13db)、調(diào)制幅度MA=5G、放大增益GN=5×104、中心磁場(chǎng)CF=3470G、掃場(chǎng)寬度SW=200G的條件下測(cè)自由基水平，證明配制后即刻已產(chǎn)生大量自由基且在一小時(shí)內(nèi)被捕捉的自由基信號(hào)強(qiáng)度無(wú)明顯改變。
1．2自由基對(duì)人紅細(xì)胞的損傷及恢復(fù)：
十名健康成人紅細(xì)胞(男女各五名)經(jīng)等滲磷酸緩沖液(PBS)清洗兩遍后分別與以上兩自由基體系在室溫條件下作用30分鐘。作用后的紅細(xì)胞經(jīng)PBS清洗兩遍后部分再于室溫條件下于PBS中靜置3小時(shí)。
1．3紅細(xì)胞血影的制備：
自由基作用前、作用30分鐘和靜置3小時(shí)的紅細(xì)胞用低滲Tris緩沖液(10mmol/LpH7．4)破膜40分鐘，高速離心(25，000轉(zhuǎn)/分，4℃)40分鐘，去上清，用低滲Tris在上述離心條件下反復(fù)清洗沉淀物數(shù)遍，直至變?yōu)槿榘咨?；再?．9％NaCl液于50，000轉(zhuǎn)/分、4℃、60分鐘的條件下清洗沉淀物，去上清后獲得紅細(xì)胞血影。
1．4紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及分子構(gòu)象的測(cè)定：
1．4．1用激光拉曼波譜分析儀(LRSSPEX-1403)在室溫、功率500mW、波數(shù)范圍950～1750cm-1、激發(fā)波長(zhǎng)518．5nm的條件下，測(cè)定紅細(xì)胞血影中β-胡蘿卜素特征譜波數(shù)1528 cm-1/1446 cm-1的改變，觀察膜中β-胡蘿卜素的構(gòu)象變化從而反映整體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變。
1．4．2將待測(cè)紅細(xì)胞100μl再懸浮于PBS中，加入10-3mol/L的3-MCP3-(3-MALEIMIDOPROPYL-CARBAMOYL)-PROXYL 8μl充分混勻，室溫靜置2小時(shí)，標(biāo)記膜蛋白巰基(-SH)。2小時(shí)后離心去上清，于室溫條件下用ESR測(cè)定標(biāo)記物的譜強(qiáng)及(測(cè)定條件SW=50G，SP=13db，MA=5G，CF=3470G，GN=5×104分子相對(duì)旋轉(zhuǎn)時(shí)間，反映膜蛋白分子的宏觀構(gòu)象改變及分子運(yùn)動(dòng)性(圖1)。
1．4．3將待測(cè)紅細(xì)胞血影均勻涂抹于CaF2載樣片上，在室溫條件下用顯微付立葉變換紅外光譜分析儀(MFT-IRPE2000)測(cè)定和記錄血影蛋白酰胺Ⅰ譜帶1600～1700cm（-1）的紅外光譜，光譜采集100次，對(duì)去卷積譜以高斯曲線擬合，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α螺旋、β折疊及卷曲等各組分的含量根據(jù)組分譜帶的相對(duì)峰面積計(jì)算獲得。同時(shí)將以上待測(cè)血影10μl懸浮于1ml的PBS中并加入樣品池中，在室溫、掃描速度50nm/min、波長(zhǎng)擴(kuò)展10nm/cm、采集8次、采樣間隔10ms、間隔時(shí)間1min、波長(zhǎng)范圍250～190nm的條件下用圓二色光譜分析儀(CD J-500C)測(cè)定并記錄血影圓二色光譜通過(guò)曲線擬合分析血影蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)各成分的改變。
1．5紅細(xì)胞膜分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的測(cè)定：
1．5．1用(MFT-IRPE2000)測(cè)定和記錄血影900～3700 cm-1范圍的譜帶，方法同1．4．3；計(jì)算3012cm-1、1234cm-1、1067cm-1峰面積比，分析膜脂分子疏水區(qū)碳-碳雙鍵(-C=C-)、親水區(qū)磷-氧雙鍵(-P=O)、膜界面區(qū)羰基(C=O)等基團(tuán)含量的變化。
1．5．2將待測(cè)紅細(xì)胞血影均勻涂抹于蓋玻片上，真空干燥后用電子能譜化學(xué)分析系統(tǒng)：(ESCA PE-PHl5300)在角分辨率45°、真空度10-10托、分辨率0．8eV、靈敏度8×104CPS、過(guò)能35．75eV、功率250W的條件下測(cè)定并記錄膜中含硫基團(tuán)(S-S、SOx、SH)、含碳基團(tuán)(C=O、C-OH)、含氮基團(tuán)(NH、NOx、NQ)的電子光譜，通過(guò)曲線擬合分析以上各化學(xué)基團(tuán)的含量及比例變化和膜中分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變。
1．6數(shù)據(jù)分析：
用T-檢驗(yàn)對(duì)自由基作用后的各實(shí)驗(yàn)參數(shù)與實(shí)驗(yàn)前有關(guān)參數(shù)進(jìn)行醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，設(shè)定P＜0．05時(shí)具有顯著性差異，各參數(shù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示。根據(jù)公式{(改變指標(biāo)-對(duì)照指標(biāo))/對(duì)照指標(biāo)}×100％=變化率(±％)計(jì)算改變幅度，+代表增加，-代表降低。
2結(jié)果
激光拉曼分析結(jié)果顯示，高濃度自由基作用后紅細(xì)胞血影的1528cm-1/1446cm-1譜峰比與作用前相比盡管沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但平均降低幅度遠(yuǎn)大于低濃度自由基體系(約-40％比-21．6％)。由于1528cm-1/1446cm-1譜峰比的升高或降低反映β-胡蘿卜素伸展構(gòu)象或卷曲構(gòu)象的比例變化，此處1528cm-1/1446cm-1譜峰比的降低則說(shuō)明了高濃度自由基作用30分鐘后，引起紅細(xì)胞膜中β-胡蘿卜素卷曲構(gòu)象成分增加，提示膜分子間隙增大，膜整體結(jié)構(gòu)改變(表1)。
無(wú)論高濃度或低濃度自由基體系作用30分鐘后，ESR測(cè)定紅細(xì)胞膜蛋白分子標(biāo)記物的相對(duì)旋轉(zhuǎn)時(shí)間均大幅度延長(zhǎng)(表2)，但低濃度自由基作用后的變化較輕。由于膜蛋白分子運(yùn)動(dòng)速度較慢，因此此處被延長(zhǎng)的相對(duì)旋轉(zhuǎn)時(shí)間除說(shuō)明膜蛋白分子運(yùn)動(dòng)性的降低外，還提示了標(biāo)記物周圍環(huán)境對(duì)其分子運(yùn)動(dòng)性的限制增加即蛋白構(gòu)象(結(jié)構(gòu))改變。有意義的是在分子旋轉(zhuǎn)時(shí)間延長(zhǎng)的同時(shí)ESR測(cè)定到的標(biāo)記物信號(hào)強(qiáng)度則成倍增加(表2)：由于標(biāo)記物特異性結(jié)合于巰基(SH)，因此不難理解在自由基作用后，紅細(xì)胞膜暴露的SH可結(jié)合位點(diǎn)增加，這是膜蛋白構(gòu)象改變的重要證據(jù)。以上改變?cè)?小時(shí)后只獲得了小部分回復(fù)，但仍明顯高于對(duì)照值，說(shuō)明自由基引起膜蛋白結(jié)構(gòu)改變幾乎是不可逆的。
CD測(cè)定的結(jié)果顯示，兩個(gè)濃度的自由基的作用都使紅細(xì)胞血影膜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋成分比例減少(減幅分別為-15．8％和-13．7％)，而β折疊及卷曲成分比例相應(yīng)增加；3小時(shí)后上述改變少回復(fù)(表3)；說(shuō)明自由基導(dǎo)致了紅細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)前面由ESR測(cè)定的自由基引起膜蛋白結(jié)構(gòu)(構(gòu)象)改變的發(fā)現(xiàn)。MPT-IR的測(cè)定結(jié)果與CD測(cè)定結(jié)果相吻合(表3)。
表4所示為ESCA測(cè)定紅細(xì)胞膜血影的含硫成分含氮成分、含碳成分的改變情況：高濃度的自由基作用后膜上巰基在總含硫基團(tuán)中的比例有所減少(減幅約-7．7％)，而S-S和SOx等基團(tuán)的比例增加(增幅分別為約+3．3％和+6％)，3小時(shí)后SH進(jìn)一步減少、S-S進(jìn)一步增加、SOx則基本回復(fù)到對(duì)照水平。在含氮基團(tuán)的變化中，亞氨基(NH)在自由基作用后有所降低(降幅為-6％)，氮=氧基(NOx)和NCx基團(tuán)相應(yīng)增加，(平均增幅為+7．7％和+2％)；3小時(shí)后NH基團(tuán)比例基本回復(fù)，NCx只部分回復(fù)(仍高出對(duì)照+1．5％)，而NOx基團(tuán)則低于對(duì)照。含碳基團(tuán)中，在自由基作用后，COH基團(tuán)比例減少，C=O基團(tuán)比例增加；3小時(shí)后COH繼續(xù)降低而CO基本回復(fù)。上述結(jié)果提示：自由基造成了紅細(xì)胞膜蛋白分子結(jié)構(gòu)的改變，其中巰基被氧化而形成雙硫鍵和氧化硫基團(tuán)，亞氨基被氧化成氧-氮基或氮-碳基結(jié)構(gòu)，碳羥基被氧化又羰基。由于SH、S-S主要存在于膜蛋白中，是蛋白重要官能團(tuán)及維持蛋白結(jié)構(gòu)(構(gòu)象)的重要化學(xué)鍵，本文中的變化則說(shuō)明了自由基作用后膜蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)上的重構(gòu)。NH基團(tuán)和COH基團(tuán)又是構(gòu)成維持蛋白正常二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵中的重要官能團(tuán)，他們的減少同樣提示了自由基對(duì)膜蛋白氫鍵的破壞。
除ESR測(cè)定的膜脂質(zhì)區(qū)分子相對(duì)旋轉(zhuǎn)時(shí)間在自由基作用后延長(zhǎng)、并于3小時(shí)后完全回復(fù)外，MFT-IR測(cè)定結(jié)果顯示，兩種濃度的自由基作用后紅細(xì)胞膜脂的磷氧雙鍵(P=O)、羰基(C=O)和碳-碳雙鍵基團(tuán)(C=C)都有所減少。由于含磷基團(tuán)多位于膜磷脂的親水端即膜表面?zhèn)?，羰基位于磷脂分子的膜親-疏水界面區(qū)、碳-碳雙鍵則是膜磷脂分子疏水端—多不飽和脂肪烴鏈的主要成分，位于細(xì)胞膜的中間部分，因此上述改變提示本研究中自由基對(duì)膜表面和膜內(nèi)部同時(shí)造成了損傷，推測(cè)自由基使膜磷脂的不飽和鍵部分轉(zhuǎn)變?yōu)轱柡玩I及羰基，這些分子結(jié)構(gòu)的改變是膜脂分子旋轉(zhuǎn)時(shí)間延長(zhǎng)的主要原因。3小時(shí)后高濃度自由基作用的紅細(xì)胞胺P=O、C=O繼續(xù)減少和C=C無(wú)回復(fù)，而低濃度自由基作用的紅細(xì)胞膜的P=O、C=C成分則有一定程度的回復(fù)(表5)，但在本研究所測(cè)的變化中總的表現(xiàn)出自由基濃度與各變化間有一定的量效關(guān)系，即隨自由基濃度增加改變加重。
3討論
本研究中對(duì)紅細(xì)胞血影中β-胡蘿卜素的構(gòu)象測(cè)定表明了自由基作用后，造成了膜整體結(jié)構(gòu)的改變。紅外測(cè)定結(jié)果則進(jìn)一步證實(shí)此時(shí)C=C減少。我們認(rèn)為這是由于自由基使部分膜磷脂疏水區(qū)烴鏈的不飽和鍵形成飽和鍵以及脂質(zhì)自由基之間的加成反應(yīng)而使脂環(huán)內(nèi)過(guò)氧化物形成所致，更重要的是我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)了自由基作用后P=O和C=O基團(tuán)的減少，說(shuō)明自由基不僅攻擊膜內(nèi)部的不飽和烴鏈，同時(shí)還損傷膜磷脂分子親水端頭部的磷酸基或磷酸膽堿基及脂分子界面區(qū)的甘油骨架，這將導(dǎo)致膜脂分子極性的改變，提示脂質(zhì)過(guò)氧化同時(shí)發(fā)生于膜表面及膜內(nèi)部。以上變化終將引起膜脂分子構(gòu)象、排列更加有序，相互作用增強(qiáng)及流動(dòng)性降低等特性，進(jìn)而影響膜的整體結(jié)構(gòu)及功能。
在自由基作用后膜脂分子改變的同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)了膜蛋白分子結(jié)構(gòu)的改變是以α螺旋成分減少，β折疊和無(wú)規(guī)卷曲成分增加為主要特征。這些變化將使插入膜脂雙層中的蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)減少，膜蛋白與膜脂分子相互作用及束縛力減弱，蛋白維持膜脂分布不對(duì)稱性和限制脂分子運(yùn)動(dòng)的作用降低，這將有利于發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的膜脂分子重新排列與分布而造成膜正常結(jié)構(gòu)改變。根據(jù)ESR的測(cè)定結(jié)果，我們認(rèn)為由于自由基損傷后膜蛋白標(biāo)記位點(diǎn)增加但同時(shí)標(biāo)記分子的運(yùn)動(dòng)又受限，說(shuō)明膜蛋白分子本身構(gòu)象的變化是以分子在膜表面部分的楔狀缺損為主。在我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)體外純蛋白與自由基作用30分鐘后也引起其結(jié)構(gòu)與紅細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)改變相似的結(jié)果，即出現(xiàn)了蛋白構(gòu)象的變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)自由基作用后使純纖維蛋白原的NH、CO等基團(tuán)減少，而NCx、NOx及COH等基團(tuán)增加，推測(cè)在自由基的作用下肽鍵一側(cè)N上的氫轉(zhuǎn)移到另一側(cè)的CO上而形成COH從而使N氧化成NOx或肽鍵雙鍵比例增加，由此蛋白分子中于CO和NH之間的氫鍵被部分破壞，進(jìn)而造成蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)(α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)卷曲)發(fā)生重構(gòu)(式3)。
(式3)自由基引起氫鍵破壞后肽鍵改變的兩種可能形式。
ESCA對(duì)紅細(xì)胞血影膜的分析結(jié)果表明，自由基作用后SH減少、S-S和SOx等基團(tuán)增加。由于巰基(SH)絕大部分為膜蛋白的特異性基團(tuán)，易被氧化而失去氫原子，因此前述含硫基團(tuán)的變化證明自由基造成了膜蛋白巰基氧化后二硫鍵和氧化硫基團(tuán)的形成，這可直接造成膜蛋白結(jié)構(gòu)(構(gòu)象)的重構(gòu)，膜蛋白自身功能及與膜脂分子之間的相互作用被打亂。與纖維蛋白原的改變相同的是，自由基作用后NH減少，NCx和NOx等基團(tuán)增加；但不同的是此時(shí)CO增加而COH降低，這可能有兩種解釋：
①因?yàn)镠2O2和OH很易穿過(guò)細(xì)胞膜，因此在它們過(guò)膜破壞膜蛋白氫鍵的同時(shí)，將NH基團(tuán)上的部分氫原子抽取，并不發(fā)生NH基團(tuán)上的氫往羰基氧上轉(zhuǎn)移因而COH降低；
②膜脂不飽和鍵被自由基氧化使CO基增加。除上述二硫鍵形成外，此處氫鍵的破壞是本文膜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)卷曲)改變的主要原因之一。因此自由基損害膜蛋白結(jié)構(gòu)的機(jī)理是自由基通過(guò)氧化巰基而形成二硫鍵，同時(shí)造成氫鍵破壞、肽鍵雙鍵成分增加，終會(huì)導(dǎo)致膜蛋白結(jié)構(gòu)、構(gòu)象的改變(發(fā)生結(jié)構(gòu)重構(gòu))。蛋白一旦發(fā)生重構(gòu)后，很難再回復(fù)到正常結(jié)構(gòu)，這可從本文中對(duì)3小時(shí)后血影蛋白分析的結(jié)果獲得證實(shí)。由于紅細(xì)胞沒(méi)有合成蛋白而修復(fù)或替換被自由基損傷的膜蛋白的能力，因此自由基造成的本文中膜蛋白的損傷是不可逆的。
有意義的是在本文中：
①自由基損傷程度表現(xiàn)出了與自由基濃度有一定的量效關(guān)系；
②自由基引起的膜脂分子部分結(jié)構(gòu)上的改變(如頭部的P=O、C=O和CO等基團(tuán)的改變)在3小時(shí)后的回復(fù)程度也與自由基濃度有關(guān)，提示自由基引起的紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的可逆性取決于損傷程度。
本文中的結(jié)果可明確地闡述我們前期有關(guān)自由基對(duì)紅細(xì)胞膜分子流動(dòng)性影響的機(jī)理：即自由基引起紅細(xì)胞膜蛋白分子及脂質(zhì)分子化學(xué)結(jié)構(gòu)及構(gòu)象的改變，從而造成這些分子間正常排列、相互作用的破壞，終使這些分子的流動(dòng)性乃至整個(gè)紅細(xì)胞膜的流變性降低；脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的部分回復(fù)可能是自由基損傷后3小時(shí)膜脂分子流動(dòng)性回復(fù)正常的主要原因，但因膜蛋白損傷的不可逆性，3小時(shí)后整個(gè)紅細(xì)胞膜的流變性、彈性模量(主要由膜骨架所決定)的改變只有部分回復(fù)。
4結(jié)論
本文利用生物物理的手段對(duì)自由基損傷后的紅細(xì)胞膜蛋白分子和脂質(zhì)分子的構(gòu)象、化學(xué)鍵的特征性改變進(jìn)行了分析，證明：
①自由基可損傷膜的完整性；
②自由基可通過(guò)氧化蛋白SH(巰基)形成S-S(二硫鍵)SOx(氧化硫)等基團(tuán)，引起氫轉(zhuǎn)移而破壞氫鍵，改變肽鍵結(jié)構(gòu)，使蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)重構(gòu)；
③自由基不僅造成脂疏水烴鏈中不飽和鍵的減少，同時(shí)還攻擊其親水頭部及界面區(qū)而引起膜磷脂分子極性、構(gòu)象和有序性的變化；
④以上膜蛋白分子的變化幾乎是不可逆的，而膜脂分子改變的可逆性與自由基損傷程度相關(guān)。