相關(guān)論壇
(北京心肺血管醫(yī)療研究中心，血液流變學(xué)研究室，北京100029)
郭金良李勇孫素琴
(清華大學(xué)化學(xué)系，北京100084)
摘要：
為探明自由基引起紅細胞流變性改變的作用機理，我們對體外自由基作用三十分鐘前后紅細胞膜剪切彈性模量、細胞表面指數(shù)、膜脂質(zhì)分子和蛋白分子流動性進行了比較分析。發(fā)現(xiàn)自由基作用后，紅細胞膜剪切彈性模量、膜脂質(zhì)分子和蛋白分子的相對旋轉(zhuǎn)時間分別增加了百分之49.8、百分之49.5和百分之191.4，而紅細胞表面指數(shù)無變化；此外，隨著自由基濃度的降低以上變化也隨之減輕；在自由基損傷后的第三小時，上述改變部分回復(fù)。本研究說明，自由基引起脂質(zhì)和蛋白分子流動性降低共同導(dǎo)致紅細胞膜剪切彈性模量的增加，并且一定濃度自由基對紅細胞流變性的損傷是部分可逆的。
關(guān)鍵詞：自由基；紅細胞膜剪切彈性模量；膜脂質(zhì)分子流動性；膜蛋白分子流動性
分類號：R318.01
0前言
除了神經(jīng)體液調(diào)節(jié)因素和灌注壓外，影響微循環(huán)灌注的主要環(huán)節(jié)還有毛細血管床的完整及良好的紅細胞流變性。當(dāng)紅細胞流經(jīng)內(nèi)徑小于自身的滋養(yǎng)毛細血管時需要變形才可通過。已有許多關(guān)于疾病病程中紅細胞的變形特性被改變的報道。紅細胞的硬度不僅受細胞內(nèi)外多種因素的影響，同時還取決于細胞膜的化學(xué)成分(脂質(zhì)和蛋白)及它們的流動性。當(dāng)某些物理化學(xué)的、感染或其他的病因引起紅細胞膜成分、結(jié)構(gòu)和代謝功能變化時都將影響膜流動性進而影響整個細胞的變形性并由此干擾微循環(huán)灌注。
自由基產(chǎn)生過量或出現(xiàn)在細胞的某些部位可造成病理學(xué)改變，特別是以氧為核心的自由基已被證明與缺血/再灌注期間的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟的病理改變有關(guān)。缺血/再灌注期間脂質(zhì)過氧化不僅破壞了細胞膜的完整性，同時還引起游離脂肪酸釋放進而導(dǎo)致了水腫和花生四烯酸代謝等病理學(xué)變化。A.M.Phelan報道了在腦缺血/再灌注期間，毛細血管內(nèi)皮細胞膜脂質(zhì)區(qū)流動性明顯降低，認為與此期間產(chǎn)生的自由基損傷有關(guān)。
但到目前尚未見有關(guān)自由基對紅細胞膜分子流變性損傷機理的研究報道。為探明自由基對紅細胞流變性的作用機理，本文除觀察了自由基對離體健康人紅細胞變形性的影響外，還探討了自由基對細胞膜脂質(zhì)和蛋白分子流動性的作用及其可能的途徑。
1材料和方法
(1)自由基體系
按照下列方法配制高、低濃度的羥自由基體系。高濃度：按1∶1∶1的容積比將3%的H2O2、450μm/L的FeSO4和百分之2.7的NaCl混合制成等滲、pH7.0的羥自由基體系；低濃度：按0.5∶1∶1.5的容積比將百分之3的H2O2、450μm/L的FeSO4和百分之1.8的NaCl混合制成等滲、pH7.0的羥自由基體系。分別在以上體系配制后的即刻、10min、30min和1h用自旋捕捉劑DMPO(5，5-diethyl-1-pyrroline-N-oxide)捕捉自由基，并于室溫下用ESR(electronic spinresonance)-電子自旋共振波譜儀測定(BRUKERER-200D，微波功率SP=10mW(13db)，調(diào)制幅度MA=5G，放大增益GN=5×104，中心磁場CF=3470G，掃場寬度SW=100G)，證明配制后即刻已產(chǎn)生自由基且在1h內(nèi)其濃度不變。
(2)自由基對紅細胞的損傷及恢復(fù)
10名健康成人新鮮紅細胞(男女各5名)經(jīng)等滲磷酸緩沖液(PBS)清洗兩遍后分別與以上兩自由基體系在室溫條件下作用30min。作用后的紅細胞經(jīng)PBS清洗兩遍后再于室溫條件下放置3h。
(3)紅細胞流變參數(shù)測定
在前期的預(yù)實驗中，采用根據(jù)M.Paulitschke等人的微吸管技術(shù)而設(shè)計的微管細胞流變儀對自由基作用后的10只大鼠紅細胞流變性變化進行的觀察發(fā)現(xiàn)：當(dāng)用內(nèi)徑為1.6～2μm的毛細管在10cmH2O的負壓吸引下，每只隨機測定8～10個細胞，即觀察到紅細胞膜剪切彈性模量顯著增高(P<0.05)。
本研究中仍采用以上微吸管法，自由基作用前后的每份紅細胞由內(nèi)徑為1.6～2μm的微吸管在8cmH2O的負壓下(ΔP)隨機吸取紅細胞懸浮液中10～12個細胞，并由圖象分析系統(tǒng)計算出每個紅細胞膜的剪切彈性模量、細胞表面指數(shù)等細胞流變學(xué)指標(biāo)，分析紅細胞剛性化程度。圖1所示為微吸管測定紅細胞流變性的方法，先后測量微管內(nèi)半徑RP、紅細胞被吸入微管內(nèi)部分的長度L和紅細胞未被吸入微管部分的直徑D，經(jīng)由計算機根據(jù)下列改進的M.Paulitschke]經(jīng)驗公式計算紅細胞膜剪切彈性模量μ、細胞表面指數(shù)Si。膜剪切彈性模量μ增加和細胞表面指數(shù)Si下降，分別代表膜流動性降低及細胞相對體積增大，表明細胞流變性下降，反之亦然。
上式中K1=2.45，K2=0.63
(4)紅細胞膜分子流動性測定
將每份經(jīng)PBS清洗兩遍后的兩個100μl紅細胞分別再懸浮于500μl的PBS中，其一加入10-3M/L的3-MCP[3-maleimdopropyl(-carbamoyl)-proxyl]8μl充分混勻，標(biāo)記紅細胞膜蛋白分子；另一加入10-3mol/L的12-DSA(12-doxyl-strearic acid)20μl充分混勻，標(biāo)記紅細胞膜脂質(zhì)分子區(qū)。室溫標(biāo)記兩小時后離心去上清。在室溫條件下用電子自旋共振波譜儀(ESR)分別測定以上標(biāo)記樣品的ESR信號(除了脂質(zhì)和蛋白分子標(biāo)記物的SW分別為100G和50G外，其他儀器參數(shù)相同，即SP=13db，MA=5G，CF=3470G，GN=5×104)，由于標(biāo)記物分子的相對旋轉(zhuǎn)時間反映這些分子運動時的周圍分子環(huán)境，因此根據(jù)下式分別計算膜蛋白(τp)及脂質(zhì)分子(τl)標(biāo)記物的相對旋轉(zhuǎn)時間以表示膜蛋白和脂質(zhì)分子流動性：
上式中τ為分子相對旋轉(zhuǎn)時間，ΔH(0)為ESR譜的中心峰的峰-峰寬，h(1)、h(0)和h(-1)分別為低場峰、中心峰和高場峰的峰高(如圖2所示)。
(5)數(shù)據(jù)分析
用T檢驗對自由基作用后的各實驗參數(shù)與實驗前有關(guān)參數(shù)進行醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)比較，設(shè)定P<0.05時具有顯著性差異，各參數(shù)以均值±標(biāo)準差(±SD)表示。
2結(jié)果
表1所示為自由基作用前后紅細胞膜剪切彈性模量和細胞表面指數(shù)的比較。無論與較高濃度或較低濃度自由基作用30min均引起完整紅細胞膜的剪切彈性模量(μ)明顯增高，增幅分別為百分之49.8和百分之42.7；3h后盡管μ值有所降低，但仍明顯高于作用前。在此期間細胞表面指數(shù)無顯著改變。
自由基作用30min后無論是蛋白或脂質(zhì)的標(biāo)記物分子的相對旋轉(zhuǎn)時間都大幅度延長，表明被標(biāo)記的膜分子有序性增加即流動性降低，其中以蛋白的變化較大；3h后，膜分子流動性有不同程度的回復(fù)，但是蛋白分子回復(fù)較少，而脂質(zhì)分子流動性幾乎回復(fù)到作用前水平(表2)。
本研究中發(fā)現(xiàn)，自由基作用后紅細胞膜蛋白標(biāo)記物3-MCP的ESR信號強度增加了數(shù)倍至十?dāng)?shù)倍(表3)，與蛋白流動性改變一樣，三小時后盡管信號強度有所回復(fù)，但仍較作用前高數(shù)倍。由于3-MCP是與細胞膜蛋白的巰基(-SH)特異性結(jié)合，因此信號的增強提示自由基損傷后紅細胞膜表面暴露的蛋白巰基數(shù)量明顯增加，說明蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，而且這一變化的可逆性較差。
與對照相比，隨著自由基濃度的降低有關(guān)參數(shù)的變化程度也隨之減輕。
3討論
自由基是自然存在并是許多生理過程所需的含有不配對電子的活性物質(zhì)。但產(chǎn)生過量或出現(xiàn)在不合適的細胞部位將會導(dǎo)致病理學(xué)改變。前期的研究發(fā)現(xiàn)易受自由基攻擊的生物結(jié)構(gòu)是脂雙層。膜磷脂對氧自由基的攻擊非常敏感的主要原因是：一、其所含的多不飽和脂肪酸的不飽和鍵是自由基攻擊的很好的靶部位，二、分子氧在膜疏水區(qū)的溶解度高于相應(yīng)的親水區(qū)。已證明在生物體中產(chǎn)生的氧衍生出的自由基導(dǎo)致了脂質(zhì)過氧化、炎癥和水腫等組織損傷。缺血/再灌注后膜的完整性的破壞及游離脂肪酸的釋放與脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生相關(guān)，并由此促進水腫和花生四烯酸的代謝等病理變化。Bruch等人利用不同的電子順磁脂肪酸氧化氮探針對人工膜的研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過氧化引起膜內(nèi)部相應(yīng)部位的改變。Anne M.Phelan通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大腦半球缺血/再灌注后只有毛細血管內(nèi)皮細胞膜疏水區(qū)的氮氧自旋標(biāo)記物12-DSA所指示的區(qū)域的微粘度明顯增加，而5-DSA和16-DSA所指示的膜脂質(zhì)分子區(qū)有序性未發(fā)生變化，這與Zaleska等人在脂質(zhì)體被自由基損傷后的發(fā)現(xiàn)一致。
因為在氧轉(zhuǎn)運中大量的氧反復(fù)穿過膜，并且膜含有豐富的非配對多不飽和脂肪酸，在這些脂肪酸中與C=C烯烴鍵相鄰的亞酰基又易失去氫原子，而紅細胞內(nèi)的血紅蛋白又為損傷性自由基的產(chǎn)生提供了氧化還原催化劑——鐵，所以紅細胞易受到過氧化損傷。當(dāng)紅細胞膜受到過氧化時，自由基更易攻擊含四個或更多烯烴鍵的多不飽和膜磷脂的酰基鏈，這些?；溨饕怯苫ㄉ南┧岷投妓南┧針?gòu)成，過氧化終會引起這些酰基鏈中烯烴鍵的減少。
紅細胞的流變性受膜流動性、胞漿粘度和細胞體積的影響，其中一個或幾個因素發(fā)生變化都會引起整個紅細胞的變形性降低，進而影響氧轉(zhuǎn)運和微循環(huán)灌注。紅細胞膜是典型的脂雙層蛋白鑲嵌結(jié)構(gòu)，部分膜蛋白構(gòu)成的細胞膜骨架不僅起著支撐細胞膜、維持膜完整性的作用，其自身也可變形；同時它還起著調(diào)控和限制膜脂分子的運動空間的作用，因此是膜流動性的重要決定因素；其他膜蛋白如一些酶類、一些受體類等等除自身的旋轉(zhuǎn)運動外也發(fā)生膜上的水平運動。膜脂分子具有旋轉(zhuǎn)、鏈擺動和水平運動等三種運動方式，無論何種方式都會受到分子結(jié)構(gòu)及周圍分子運動的影響。因此紅細胞膜的流動性是由膜脂分子和蛋白分子流動性及它們彼此相互作用所決定。
本文中自由基作用后紅細胞膜剪切彈性模量明顯增加而不伴有細胞指數(shù)的明顯改變說明了自由基引起細胞膜的剛性化是紅細胞流變性降低的主要原因；而自由基作用后除12-DSA指示的膜脂質(zhì)分子有序性明顯增加的結(jié)果與上述作者的發(fā)現(xiàn)一致外，同時還發(fā)現(xiàn)膜蛋白分子的有序性也明顯增加，其增幅大于脂質(zhì)的變化，說明脂質(zhì)和蛋白分子流變學(xué)的變化共同作用于以上膜剪切彈性模量的改變。如前所述，自由基引起了膜脂質(zhì)過氧化主要表現(xiàn)為磷脂疏水區(qū)?；溨邢N鍵的減少、分子結(jié)構(gòu)的變化，此外我們的同期研究發(fā)現(xiàn)自由基還引起膜磷脂親水區(qū)中含磷基團的磷-氧雙鍵與磷-氧單鍵(P＝O/P-O)的比例異常，這是本文中膜脂分子流動性降低的主要原因。有意義的是本文發(fā)現(xiàn)在自由基作用后膜蛋白分子標(biāo)記物信號強度明顯增強和標(biāo)記物的強固定化同時出現(xiàn)，不僅提示了膜表面蛋白暴露的標(biāo)記位點增加且其中的部分位點是在蛋白分子的內(nèi)部，提示自由基引起了膜表面蛋白楔狀缺損的分子結(jié)構(gòu)變化，這是本文中膜蛋白流動性降低的主要分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
至今未曾見到有關(guān)自由基損傷后紅細胞流變性回復(fù)情況的研究報道。本文對自由基損傷后紅細胞流變性有關(guān)指標(biāo)的動態(tài)觀察表明，三小時后無論是細胞膜的剪切彈性模量或膜脂質(zhì)、蛋白分子流動性均有不同程度的回復(fù)，其中脂質(zhì)分子流動性幾乎完全回復(fù)到作用前水平；而蛋白分子流動性回復(fù)比較小，這與蛋白分子標(biāo)記信號的回復(fù)情況相似。提示自由基對紅細胞流變性的損傷是部分可逆的，這主要是由于膜脂質(zhì)分子流動性的回復(fù)，而就紅細胞流變性不能完全回復(fù)的主要原因是由于自由基損傷導(dǎo)致了蛋白分子結(jié)構(gòu)的重構(gòu)(一旦蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)，其損傷或變化則難以回復(fù))，使蛋白分子與周圍分子的關(guān)系發(fā)生變化從而導(dǎo)致流動性不易回復(fù)。從本文中的結(jié)果還可看出自由基對紅細胞流變性的損傷程度與自由基濃度有關(guān)。
根據(jù)上述各點我們認為，在許多具有產(chǎn)生大量自由基的臨床條件下(如心肌梗塞、腦梗塞、開心手術(shù)期間的缺血/再灌注和炎性過程)，紅細胞膜上的磷脂和蛋白分子在自由基的攻擊下而發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變，這些變化不僅使分子自身的旋轉(zhuǎn)運動和鏈擺動降低，同時通過改變分子間的關(guān)系而限制周圍分子的運動，從而降低了完整紅細胞膜的流動性并終會導(dǎo)致紅細胞變形性的下降影響循環(huán)及微循環(huán)灌注。
國家自然科學(xué)基金、北京市自然科學(xué)基金支持項目
1995年5月30日收稿，1995年10月20日修回