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《第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)》1995年05期
陸松敏劉建倉(cāng)郭素清王成英劉光海陳惠孫
【摘要】：
采用家兔失血性休克模型，測(cè)定紅細(xì)胞膜脂的流動(dòng)性，膜脂區(qū)微粘度及相變溫度。
結(jié)果說(shuō)明失血性休克后紅細(xì)胞膜的熒光偏振度（P）升高，從0．260±0．020升至0．289±0．015（P＜0．01），膜流動(dòng)性降低。膜脂雙層分子排列有序性增加。相變溫度傷前為17．5℃，低血壓３ｈ后相變溫度為24．5℃，分子活化能升高。說(shuō)明失血性休克后紅細(xì)胞膜從相對(duì)比較流動(dòng)變?yōu)橄鄬?duì)固化，細(xì)胞膜更趨于凝膠相。
【作者單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所第二研究室
【關(guān)鍵詞】：休克失血性紅細(xì)胞膜膜流動(dòng)性
【基金】：全軍“八五”攻關(guān)項(xiàng)目
細(xì)胞膜的流動(dòng)性是一個(gè)細(xì)胞水平較為靈敏的檢測(cè)指標(biāo)，它反映細(xì)胞膜脂區(qū)分子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和分子排列的有序性，它是維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)所必需的。為了更好地從細(xì)胞和分子水平研究休克機(jī)理，我們研究了失血性休克條件下紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性、微粘度、膜脂區(qū)相變溫度、脂雙層分子排列有序性系數(shù)及分子運(yùn)動(dòng)所需活化能。
１材料和方法
采用體重2．5kg左右健康雄性家兔20只，分為對(duì)照組和失血性休克組，每組10只。采用改良Wigger’s模型，快速放血至5．3kPa，維持2h，然后繼續(xù)觀察至5h，分別于失血性休克前、低血壓后1、2、3、5h抽取靜脈血3ml，測(cè)定紅細(xì)胞膜脂流動(dòng)性，微粘度(η)和脂分子排列有序性系數(shù)(r)。
2紅細(xì)胞膜的制備
全血3ml，300×g離心10min，去上清及界面白色膜、留壓積紅細(xì)胞。再用pH7．8～8．00 0．01 mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液(PBS)洗3次(0～4℃)，每次離心5min，轉(zhuǎn)速為300～g，得3ml PBS紅細(xì)胞懸液，以體積1：80的比例，用5mmol/L Tris-HCl(pH；7．5～7．6)緩沖液實(shí)行一次性溶血，于4℃靜置1～2h取出，以1000×g 4℃離心15min，反復(fù)洗滌離心4次得白色紅細(xì)胞膜，用Lowry法定蛋白。
取膜懸液(300μg/ml)3ml，加入2×10-6濃度的DPH(1．6-Dipheny-1、3、5 Hexatrine、Sigma、ChemicalCo)30μl，于25℃溫育30min，在MPF-4型熒光分光光度計(jì)上測(cè)定熒光偏振度(P)，計(jì)算微粘度(η)和分子排列有序性系數(shù)(r)。測(cè)定時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)為365nm，發(fā)射波長(zhǎng)為440nm。
式中Ivv為起偏器光軸為垂直方向，檢偏器光軸為垂直方向時(shí)熒光強(qiáng)度，IvH為起偏器光軸為垂直方向，檢偏器光軸為水平方向時(shí)熒光強(qiáng)度。G為校正因子，G=IHV-HV/IHH，IHV為起偏器光的水平向、檢偏器垂直向時(shí)熒光強(qiáng)度。IHH：二者均為水平向。
膜相變溫度的測(cè)定采用熒光偏振法：將已用DPH標(biāo)記好的紅細(xì)胞膜懸液，置0℃冰浴后，從0℃至45℃每升高5℃測(cè)定一次熒光偏振度，再以log(P)對(duì)1/T作圖，其曲線的拐點(diǎn)即紅細(xì)胞膜的相變溫度。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3．1失血性休克對(duì)紅細(xì)胞膜流動(dòng)性、膜脂區(qū)微粘度（η）及脂雙層分子排列有序性系數(shù)(r)的影響
在失血性休克低血壓2h后紅細(xì)胞膜熒光偏振度升高(P<0．01)，膜流動(dòng)性降低，微粘度顯著升高(P<0．01)，脂雙層分子排列有序性增加(P<0．01)。隨著休克時(shí)間的延長(zhǎng)脂分子排列更有序，分子運(yùn)動(dòng)減少。三者變化關(guān)系基本平行(表1)。
3．2失血性休克時(shí)紅細(xì)胞膜相變溫度的變化
傷前、失血性休克后2、3、5h紅細(xì)胞膜在不同溫度下的熒光偏振度(P)變化見(jiàn)表2。以logp對(duì)1/T作圖，曲線的拐點(diǎn)即為相變溫度．結(jié)果為：傷前紅細(xì)胞膜相變溫度為17．5℃，失血性休克后2h為21℃，3h為24．5℃，5h為25．0℃。說(shuō)明失血性休克后紅細(xì)胞膜分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成發(fā)生了變化。
4討論
細(xì)胞膜的流動(dòng)性指細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體膜系統(tǒng)具有類(lèi)似于液體那樣容易流動(dòng)的一種物理性質(zhì)。1972年Singer和Nicolgon提出細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)的液態(tài)鑲嵌模型，即膜中脂和蛋白質(zhì)分子處于不停息的運(yùn)動(dòng)中，從而使膜處于一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)中。這些運(yùn)動(dòng)和溫度有關(guān)。所以在不同溫度下膜擴(kuò)散速度和旋轉(zhuǎn)速度及烴鏈的活動(dòng)均不同，使得膜在高溫下更接近液態(tài)，而在低溫下更接近固態(tài)，兩種狀態(tài)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)稱(chēng)之為相變溫度。
細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性是細(xì)胞的基本和重要的生物物理性質(zhì)，膜流動(dòng)性不僅能影響膜通透，且影響膜上的酶的活性、受體功能及能量傳遞，也影響細(xì)胞膜的保護(hù)功能。膜流動(dòng)性反映著膜磷脂的分子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，包括側(cè)向擴(kuò)散，繞分子長(zhǎng)軸的旋轉(zhuǎn)、異構(gòu)運(yùn)動(dòng)和翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。流動(dòng)性是脂雙層中磷脂分子各種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的總和的平均表現(xiàn)。流動(dòng)性越大，則意味著磷脂分子的活動(dòng)度增大。
膜流動(dòng)性可用核磁共振，電子自旋共振，熒光偏振等方法來(lái)測(cè)定。本研究采用穩(wěn)態(tài)熒光偏振法，因?yàn)镈PH能嵌于脂雙層中和磷脂分子平行排列，烴鏈不活動(dòng)，則DPH排列整齊，熒光偏振度大，膜流動(dòng)性??；如果分子運(yùn)動(dòng)大，脂分子呈不同程度的傾斜，則熒光偏振度小，流動(dòng)性就越大。
影響膜流動(dòng)性的因素很多，從構(gòu)成膜的磷脂和蛋白質(zhì)來(lái)看；磷脂分子中脂肪酸鏈的不飽和程度，脂與脂、脂和蛋白質(zhì)之間的相互作用均十分重要。膜磷脂的化學(xué)組成、不飽和程度、脂肪鏈的長(zhǎng)短均起作用。Orly和Sehram報(bào)告減少不飽和程度，增加鏈長(zhǎng)均可減少膜流動(dòng)性。磷脂中不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸比值越高，則膜流動(dòng)性就越大。此外膜脂的構(gòu)型、酸堿、氧張力、乙醇胺等對(duì)流動(dòng)性均有影響。
磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺均是天然哺乳動(dòng)物生物膜的主要成份。Hirata和Axelrod報(bào)告磷脂酰乙醇胺甲基化形成磷脂酰膽堿，從而增加膜流動(dòng)性。休克時(shí)膜成份分析指出：肝細(xì)胞膜中磷脂酰膽堿較多地被水解，而磷脂酰乙醇胺水解較少。磷脂酰膽堿含量下降，所以流動(dòng)性下降，相變溫度升高。
磷脂酶A2(PLA2)在許多生化過(guò)程中和細(xì)胞膜改變中是一個(gè)關(guān)鍵性的酶，是休克的重要啟動(dòng)因子。外源性PLA2和嵌于細(xì)胞膜深層的PLA2對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性起重要調(diào)控作用，調(diào)節(jié)著膜結(jié)構(gòu)，改變膜流動(dòng)性。外源性PLA2能消化細(xì)胞膜，水解不飽和脂肪酸的C-2位，從而增加飽脂肪酸/不飽和脂肪酸之比，故此改變流動(dòng)性，使細(xì)胞膜從相對(duì)地流動(dòng)變得權(quán)對(duì)固體化。Liu-Maw-Shung等指出PLA2激活是內(nèi)毒素休克的重要機(jī)制之一。我們的實(shí)驗(yàn)已證明失血性休克、內(nèi)毒素休克時(shí)，血漿、肝、心、腸中PLA2顯著升高。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明；失血性休克早期和晚期細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，膜相變溫度升高與分子排列有序性增加和分子活化能升高有關(guān)。細(xì)胞膜從相對(duì)較流動(dòng)變得更趨于凝膠相。造成膜流動(dòng)性變化的原因可能與磷脂酶激活、膜脂成份改變、不飽和脂肪酸水解、不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸之比改變有關(guān)。Stark等指出：磷脂成份變化主要原因是花生四烯酸及大量脂介質(zhì)的釋放，如溶血性磷脂酰膽鹼、血小板激活因子、烷酸類(lèi)、白三烯等大量不飽和脂肪酸釋放于脂肪池從而影響膜的流動(dòng)性。
在休克時(shí)膜的蛋白和脂肪酸上的NH2可與脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛交聯(lián)，使流動(dòng)性下降。同時(shí)不飽和脂肪酸氧化后，不飽和鍵大量減少，膜脂相凝固點(diǎn)相對(duì)升高，流動(dòng)性降低，相變溫度升高。Petkova等證明膜流動(dòng)性與膜上內(nèi)源性PLA2呈負(fù)相關(guān)，即膜的硬化可激活內(nèi)源性PLA2。同時(shí)又指出：改變脂質(zhì)體的脂成份就改變了膜的流動(dòng)性。影響細(xì)胞膜流動(dòng)性的因素很多，各種細(xì)胞毒素因子的調(diào)控作用、?；D(zhuǎn)移與基因表達(dá)的關(guān)系等均待進(jìn)一步深入研究。
實(shí)驗(yàn)證明決定低血容量休克復(fù)蘇后的存活率和存活時(shí)間的因素之一是休克狀態(tài)持續(xù)的時(shí)間。嚴(yán)重創(chuàng)傷出血后前1個(gè)小時(shí)之后活存率明顯下降。前1小時(shí)被稱(chēng)為“黃金小時(shí)”。朝鮮和越南戰(zhàn)爭(zhēng)的經(jīng)驗(yàn)使軍醫(yī)相信這段時(shí)間是關(guān)鍵時(shí)刻，而本實(shí)驗(yàn)報(bào)告了失血性休克后紅細(xì)胞膜生物物理參數(shù)的變化，說(shuō)明休克后細(xì)胞膜流動(dòng)性下降、細(xì)胞膜從相對(duì)比較流動(dòng)變得比較固化，紅細(xì)胞膜更趨于凝膠相。分子排列有序性增加，電子活化能升高，電子在能級(jí)間傳遞和躍遷困難。同時(shí)流動(dòng)性改變也必然影響到膜上酶、受體等的功能。這與休克的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞膜的流動(dòng)性和膜脂相變溫度在失血性休克后1h無(wú)顯著改變，2h后產(chǎn)生了顯著改變，提示了以上臨床改變的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。