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尚金星張梅趙自剛
《河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)》2008年06期
【作者單位】：河北北方學(xué)院；河北北方學(xué)院病理生理學(xué)教研室；
【關(guān)鍵詞】缺氧；細(xì)胞凋亡；凋亡基因
細(xì)胞凋亡（apoptosis）是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的過程。大量研究表明，心肌細(xì)胞的凋亡可能與組織中抗細(xì)胞凋亡基因與促凋亡基因的表達(dá)失衡有關(guān)，同時(shí)也可受細(xì)胞周圍的刺激信號(hào)所誘導(dǎo)或抑制。缺氧是因組織供氧減少或利用氧障礙引起細(xì)胞發(fā)生代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)異常變化的病理過程。研究顯示組織缺氧可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，如復(fù)制心肌細(xì)胞缺氧模型中可觀察到偽足縮短或消失，緊密的星形心肌細(xì)胞變得疏松孤立，呈條索狀；細(xì)胞核發(fā)生斷裂，呈分葉、碎片狀，核膜完整包被形成凋亡小體；細(xì)胞質(zhì)皺縮，核固縮、深染，染色質(zhì)濃集等主要凋亡形態(tài)變化特征。同時(shí)，缺氧也可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡；李雅莉等認(rèn)為神經(jīng)元凋亡是腦缺血缺氧損傷的主要形式。探討缺氧致細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制是臨床干預(yù)缺氧性損傷的基礎(chǔ)，本文綜述其發(fā)生機(jī)制。
1線粒體損傷
細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化、能量代謝和抗活性氧化均有賴于線粒體的功能。研究表明，缺氧所致的細(xì)胞凋亡，均先表現(xiàn)為線粒體功能紊亂，尤其是線粒體跨膜電位(△ψm)的破壞。組織細(xì)胞缺氧時(shí)，細(xì)胞膜離子泵功能障礙，膜通透性增強(qiáng)，膜流動(dòng)性下降，膜受體功能障礙導(dǎo)致Na+大量內(nèi)流，胞內(nèi)Na+濃度升高，可激活鈉泵增加Na+排出，從而消耗大量ATP，這又進(jìn)一步增強(qiáng)線粒體氧化磷酸化過程。嚴(yán)重缺氧時(shí)，ATP生成減少，使鈉泵功能障礙，細(xì)胞內(nèi)Na+增多，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈉水潴留，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，線粒體腫脹。當(dāng)線粒體部位的PO2降到臨界點(diǎn)1mmHg時(shí)，可抑制線粒體內(nèi)脫氫酶的功能，ATP生成進(jìn)一步減少，呼吸鏈被破壞。
在凋亡過程中起重要作用的不僅是線粒體呼吸鏈活性的喪失，更重要的是細(xì)胞色素C（Cyt C）自線粒體的釋放。Cyt C是一種核編碼的蛋白質(zhì)，分子量約14.5KU，位于線粒體內(nèi)膜的呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ和Ⅳ之間，在傳遞電子和ATP生成過程中起重要作用。生理情況下，線粒體內(nèi)膜對(duì)物質(zhì)通透具有高度選擇性，CytC很難從內(nèi)膜進(jìn)入胞質(zhì)中。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞在各種有害因素如缺血缺氧、自由基生成增多、胞內(nèi)鈣超載等刺激下，通過胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或直接使線粒體結(jié)構(gòu)受損，線粒體應(yīng)激，使線粒體內(nèi)外膜間的通透性轉(zhuǎn)換孔（permeability transition pore，PTP）開放，使凋亡啟動(dòng)因子如呼吸鏈成分Cyt C自線粒體釋放入胞質(zhì)中。CytC作為一種凋亡誘導(dǎo)蛋白可以激活其他凋亡蛋白的活化，其在細(xì)胞質(zhì)中與半脘氨酸蛋白酶-9（caspase-9）酶原、凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activationfactor-1，APAF-1）結(jié)合在一起形成一巨大的復(fù)合物，caspase-9得以激活，接著又激活了caspase-3，從而引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入了不可逆的“被刪除”階段。
線粒體改變引起細(xì)胞凋亡已知有5種機(jī)制：
①電子傳遞、氧化磷酸化和ATP產(chǎn)生的破壞；
②釋放激活caspases家族的蛋白，如Cyt C；
③改變細(xì)胞氧化還原潛能；
④細(xì)胞自發(fā)的受Bcl-2抑制的核固縮和DNA裂解依賴線粒體的存在；
⑤線粒體釋放的死亡因子還包括：AIF、Smac/D IABALOAIF、Endo-nuclease G。
2鈣超載
自從Kaiser等發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞凋亡與Ca2+內(nèi)流增加有關(guān)以來，越來越多的直接或間接證據(jù)表明胞漿Ca2+濃度上升是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要事件。Ca2+作為第二信使或死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，通過參與某些和細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白激酶和核酸酶的活化介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。缺氧時(shí)是導(dǎo)致Ca2+超載常見原因，其機(jī)制有：
①缺氧時(shí)，鈉泵功能受損，Na+離子大量內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Na+明顯升高，Na+/Ca2+交換蛋白以反向轉(zhuǎn)運(yùn)的方式將細(xì)胞內(nèi)排出、Ca2+進(jìn)入細(xì)胞；
②缺氧時(shí)，細(xì)胞膜嚴(yán)重受損，對(duì)Ca2+的通透性大大增加；
③缺氧時(shí)產(chǎn)生大量氧自由基，自由基可以造成肌漿網(wǎng)膜損傷，鈣泵功能抑制，使肌漿網(wǎng)攝Ca2+減少，胞漿濃度升高；
④線粒體膜損傷抑制氧化磷酸化過程，使ATP生成減少，細(xì)胞膜和肌漿網(wǎng)攝鈣能量供應(yīng)不足，促進(jìn)鈣超載的發(fā)生。
鈣超載被認(rèn)為是導(dǎo)致凋亡的重要因素，其主要機(jī)制有：
①激活與凋亡有關(guān)的各種酶，包括激活鈣依賴性核酸內(nèi)切酶使DNA降解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；
②激活誘生型一氧化氮合酶，引起NO合成增加，高濃度的NO使DNA中嘌呤和嘧啶脫氨基，引起突變和DNA鏈斷裂；同時(shí)NO可降低胞漿的pH，并抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成；NO還增加p53表達(dá)及減少細(xì)胞ATP合成，NO的這些細(xì)胞毒性可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；
③激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化細(xì)胞內(nèi)肽鏈間的?；D(zhuǎn)移，在肽鍵間形成共價(jià)鍵，使細(xì)胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體的形成；
④激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；
⑤Ca2+在ATP的配合下使DNA鏈?zhǔn)嬲梗┞冻龊诵◇w之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點(diǎn)，有利于DNA核酸內(nèi)切酶切割DNA。
3自由基損傷
在誘發(fā)細(xì)胞凋亡的諸多因素中，內(nèi)源性或外源性因素產(chǎn)生的自由基增多均被證實(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Tory等通過特異性抑制PC12神經(jīng)細(xì)胞系中Cu-Zn-SOD合成，證明SOD活力下降可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這種凋亡是氧自由基誘導(dǎo)的。Lennon等對(duì)4種不同造血細(xì)胞HL60、U937、Molt-4和Daudi進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）直接引起細(xì)胞凋亡。劉戎等證實(shí)ROS可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抗氧化劑可阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生。缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，可以增強(qiáng)Ca2+依賴性蛋白激酶的活性，促進(jìn)自由基的生成，還可以協(xié)同其他因素（如GSH下降）引發(fā)線粒體大量產(chǎn)生ROS。氧自由基化學(xué)性質(zhì)活潑，破壞機(jī)體正常的氧化/還原的動(dòng)態(tài)平衡，造成生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)）的氧化損傷，干擾正常的生命活動(dòng)，形成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激（oxidative stress）狀態(tài)，機(jī)體氧化損傷的后果之一就是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
自由基可以通過以下途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡：
①氧自由基引起的DNA損傷可激活p53基因；
②氧自由基引起的DNA損傷可活化多聚ADP核酸合成酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量消耗；
③氧自由基攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，通過脂質(zhì)過氧化作用直接造成細(xì)胞膜的損傷；細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸（如：花生四烯酸）的氧化產(chǎn)物過氧羥基24碳四烯酸可誘發(fā)細(xì)胞凋亡；
④氧化應(yīng)激激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，也可以產(chǎn)生膜的發(fā)泡現(xiàn)象；
⑤氧化應(yīng)激引起細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)破壞，可改變細(xì)胞膜的通透性使Ca2+內(nèi)流增加；
⑥自由基對(duì)線粒體膜的損害導(dǎo)致其通透性和膜電位改變；
⑦氧化應(yīng)激可活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1，加速細(xì)胞凋亡相關(guān)的一些基因表達(dá)；
⑧氧自由基通過影響某些酶活性蛋白質(zhì)的活性，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。
4低氧誘導(dǎo)因子-1與p53
近年的研究顯示嚴(yán)重或持續(xù)缺氧時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Helton等在成年大鼠腦缺氧研究中，發(fā)現(xiàn)敲除大腦HIF-1α基因后可引起凋亡基因表達(dá)水平下降，從而減少大腦細(xì)胞發(fā)生凋亡。HIF-1是細(xì)胞及組織缺氧情況下產(chǎn)生的一種氧依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子，廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，能誘導(dǎo)多種缺氧反應(yīng)性表達(dá)，使細(xì)胞及組織產(chǎn)生一系列反應(yīng)以適應(yīng)缺氧環(huán)境。HIF-1為缺氧應(yīng)答的全局性調(diào)控因子，在缺氧誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，對(duì)缺氧具有特異感受性，參與體內(nèi)許多缺氧反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，在低氧性肺損傷介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中有著重要的作用。HIF是由α和β亞基組成的異二聚體，α亞基表達(dá)受低氧誘導(dǎo)，β亞基則屬構(gòu)建型表達(dá)。序列同源性α亞基目前認(rèn)為有三種：HIF-1α、HIF-2α（也稱為EPAS1、MOP2、HLF、HRF）、HIF-3α，三者均受氧調(diào)節(jié)，是調(diào)節(jié)HIF活性的功能亞單位，三者在結(jié)構(gòu)和功能上有許多相似之處。而β亞基不受調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因p53、p21、Bcl-2蛋白的調(diào)節(jié)，常氧時(shí)，HIF-1α通過泛素-蛋白溶解酶體通路降解而幾乎檢測(cè)不到，因其t1/2很短（約5min）。但細(xì)胞低氧時(shí)（如1%氧濃度）其t1/2增加到約30min。HIF-1調(diào)節(jié)的基因涉及細(xì)胞能量代謝、離子代謝、兒茶酚胺代謝及血管的發(fā)生，其介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的基因包括：促紅細(xì)胞生成素（Epo）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和3、血紅素氧化酶l、運(yùn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因及編碼p53、p21、Bcl-2的基因。
缺氧可能是p53常見的生理誘導(dǎo)因素。研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)缺氧誘導(dǎo)的凋亡所必需的p53能抑制HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活。p53蛋白是一種定位于細(xì)胞核的磷蛋白，能夠促進(jìn)細(xì)胞的終末分化和細(xì)胞凋亡，機(jī)體各組織均有p53表達(dá)，但快速的代謝轉(zhuǎn)換使正常細(xì)胞的p53蛋白量維持于低水平。除了與凋亡密切相關(guān)，p53還被證實(shí)是一種轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，低氧能增加神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等的凋亡以及凋亡相關(guān)因子p53，Bax表達(dá)的顯著變化。國外有學(xué)者認(rèn)為，低氧環(huán)境下產(chǎn)生兩種形式的p53，即野生型p53和突變型p53，分別在細(xì)胞凋亡和血管生長過程中發(fā)揮重要作用。有學(xué)者證實(shí)缺氧可誘導(dǎo)野生型胚胎干細(xì)胞p53的表達(dá)，但在HIF-1α基因缺陷的胚胎干細(xì)胞中，p53蛋白水平則沒有明顯變化，從而推測(cè)缺氧時(shí)p53蛋白水平的升高是HIF-1α依賴性的。并證實(shí)HIF-1α是通過直接結(jié)合p53，增加后者穩(wěn)定性，從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。但Chen D在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HIF-1α不能直接結(jié)合p53，而是直接與起橋梁作用的p53泛素連接酶Mdm2結(jié)合，HIF-1α通過抑制Mdm2介導(dǎo)的p53降解并阻止Mdm2介導(dǎo)的p53核轉(zhuǎn)移，增加p53穩(wěn)定性?；罨膒53進(jìn)入核內(nèi)，通過調(diào)控其下游基因p21/Waf1/Cip1和bax的表達(dá)，啟動(dòng)相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)途徑，或通過誘導(dǎo)線粒體通透性改變而直接轉(zhuǎn)位至線粒體，引起細(xì)胞周期停滯，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。
5 Fas/Fas L
Fas蛋白是細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體家族，由胞外外結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及胞漿內(nèi)區(qū)域構(gòu)成。作為一個(gè)膜受體，F(xiàn)as蛋白可以和T淋巴細(xì)胞表面的配體結(jié)合，也可以與抗Fas的抗體結(jié)合，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。Fas蛋白介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能有：
①Fas L或抗Fas的抗體與Fas蛋白結(jié)合，引起神經(jīng)鞘磷脂酶的活性迅速上升，使神經(jīng)鞘磷脂分解產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺作為第二信使激活相應(yīng)的蛋白激酶，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
②抗Fas抗體或腫瘤壞死因子與Fas蛋白結(jié)合后可以激活I(lǐng)CE（IL-1βconverting enzyme）樣的caspase，后者可以降解H1組蛋白，使染色體松弛，DNA鏈?zhǔn)嬲?，而暴露出核酸?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，使DNA鏈更容易被切割。
③Fas蛋白激活后也可以通過Ca2+信號(hào)傳遞死亡信息而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)，在FAS/FASL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，F(xiàn)AS和FAS L交聯(lián)能夠引起細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加和細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改變。Suzuki等用化學(xué)熒光指示劑Chemluminescence（該指示劑能與包括O2-、OH、單線氧等各種ROS反應(yīng)）觀察B淋巴瘤細(xì)胞株BJAB和Ramos以及T淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株Jurkat在Fas/Fas L交聯(lián)后胞內(nèi)ROS含量變化，發(fā)現(xiàn)Fas/Fas L交聯(lián)引起細(xì)胞內(nèi)特異性ROS迅速產(chǎn)生，因此，F(xiàn)as/Fas L還可以通過自由基的作用導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
總之，缺氧是許多疾病發(fā)展過程中一個(gè)重要的病理過程，細(xì)胞凋亡是缺氧損傷的重要形式，缺氧可通過線粒體損傷、Ca2+超載、自由基、HIF-1、p53、Fas/Fas L等多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。