相關(guān)論壇
張震宇劉偉楊衛(wèi)良畢鄭鋼
哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科
摘要：
目的：
研究缺血性損傷和缺血再灌注損傷的發(fā)生情況和病理改變，探討細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因p53、p21、Bax、Bcl-2的表達(dá)規(guī)律。
方法：
建立大鼠后肢缺血和缺血再灌注實驗?zāi)Ｐ?，光鏡下觀察缺血和缺血再灌注早期的骨骼肌組織病理學(xué)變化，檢測缺血和缺血再灌注過程中細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生及相關(guān)基因p53、p21、Bax、Bcl-2的表達(dá)。
結(jié)果：
缺血5h的大鼠骨骼肌全部存活，而缺血9h者未獲存活。缺血和缺血再灌注損傷引起骨骼肌細(xì)胞水腫、壞死和細(xì)胞凋亡，并于再灌注過程觀察到微循環(huán)障礙和中性粒細(xì)胞趨化浸潤現(xiàn)象。缺血7h細(xì)胞凋亡率更高，相關(guān)基因p53、p21、Bax表達(dá)與缺血時間成正比，而Bcl-2表達(dá)與缺血時間成反比。
結(jié)論：
細(xì)胞凋亡是缺血和缺血再灌注損傷的重要病理學(xué)改變。
微循環(huán)障礙和中性粒細(xì)胞趨化浸潤是缺血再灌注損傷的重要原因之一。
相關(guān)基因表達(dá)與凋亡的發(fā)生關(guān)系密切。
肌肉組織缺血再灌注損傷是近年研究的熱點之一，但多集中在心肌等平滑肌的研究，對骨骼肌的研究較少。本研究試圖通過對骨骼肌不同缺血時段缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡指數(shù)及相關(guān)基因表達(dá)的監(jiān)測，探討骨骼肌缺血再灌注損傷后基因調(diào)控的規(guī)律及其生物學(xué)意義。
材料與方法
一、實驗動物和分組
健康Wistar大鼠40只[由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心提供，許可證號：SYXK(黑)2006-023]，體質(zhì)量250～300s，雌雄不限，清潔級。隨機取其中8只為實驗對照組，另32只，隨機分為4組，每組8只，做缺血再灌注動物實驗?zāi)Ｐ?，根?jù)缺血時間3h、5h、7h、9h分別稱為3h組、5h組、7h組、9h組，各組再灌注時間均為3h。
二、試劑
細(xì)胞凋亡試劑盒、小鼠抗p21、p53，Bax、Bcl-2蛋白抗體、SABC試劑盒均購白武漢博士德公司。
三、大鼠缺血再灌注模型建立方法
根據(jù)Gaines等的方法改進，大鼠以體積百分比為0．5％的戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉。于股骨中段水平切斷所有股部肌肉至股骨，保留股動靜脈、股神經(jīng)及坐骨神經(jīng)。實驗組于室溫(20℃左右)以微血管夾夾閉股動靜脈，每1h變換夾閉部位，達(dá)到預(yù)期缺血時間后，放松微血管夾，形成再灌注，灌注3h，縫合肌肉及皮膚。對照組不夾閉股動靜脈，僅離斷肌肉，取材后原位縫合肌肉。術(shù)后大鼠單獨飼養(yǎng)。
四、組織取材方法
實驗組大鼠，缺血3、5、7、9h再灌注3h后各時間點分別取材，取大鼠小腿后群肌0．5cm×0．5cm×0．5cm大小肌肉組織。
對照組離斷肌肉組織后當(dāng)時及其后3、5、7、9h分別取材，取大鼠小腿后群肌0．5cm×0．5cm×0．5cm大小肌肉組織。
標(biāo)本采用手術(shù)后切除的石蠟包埋組織。4μm連續(xù)切片，分別用于HE染色和免疫組化染色。
五、術(shù)中術(shù)后大體觀察指標(biāo)
缺血模型建立后觀察皮膚顏色、肌肉斷端滲血、末梢血液循環(huán)，以判斷是否實現(xiàn)缺血。
缺血再灌注模型建立后，觀察皮膚顏色、肌肉斷端滲血、末梢血運、動脈搏動、靜脈回流和充盈，以判斷去除微血管夾后的血運恢復(fù)情況。
術(shù)后觀察后肢的皮膚顏色、末梢血液循環(huán)，以判斷成活情況。
六、檢測方法
取缺血3、5、7、9h再灌注3h后各時間點的骨骼肌組織，檢測骨骼肌組織細(xì)胞凋亡情況和p53、p21、Bax、Bcl-2的表達(dá)。
1．細(xì)胞凋亡的檢測：
采用武漢博士德公司的細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。應(yīng)用原位DNA斷裂位點的3’-基末端標(biāo)記法(TUNEL法)，DAB顯色，之后用蘇木素液輕度復(fù)染，脫水，二甲苯透明，封固切片。
2．p53、p21、Bak、Bcl-2的檢測：
4μm厚切片，60℃烤片3h，SABC法免疫組化染色技術(shù)，之后用蘇木素液輕度復(fù)染，脫水，二甲苯透明，封固切片。
七、統(tǒng)計學(xué)分析
所有數(shù)據(jù)采用SPSS11．0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量資料采用x±s表達(dá)，相關(guān)基因比較采用配對t檢驗，凋亡率比較采用X2檢驗，P＜0．05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果
一、術(shù)中、術(shù)后的大體觀察結(jié)果
缺血5h以內(nèi)的骨骼肌全部成活，末梢痛覺保存較好；缺血7h的8只大鼠中4只后肢漸變?yōu)樽虾谏K壞死，4只大鼠后肢存活，但末梢痛覺不良；所有缺血9h的肢體，皮膚終漸變?yōu)樽虾谏瑹o存活，解剖股動靜脈主干無明顯血栓形成。
二、組織學(xué)觀察結(jié)果
再灌注3h內(nèi)，連續(xù)觀察HE染色組織玻片，可見明顯的缺血再灌注損傷出現(xiàn)。以缺血3h再灌注3h，近60％的肌細(xì)胞出現(xiàn)空泡，大量中性粒細(xì)胞浸潤到血管外，肌膜周邊可見浸潤的中性粒細(xì)胞。缺血3h與5h的肌組織缺血再灌注后病理變化規(guī)律相似，損傷明顯，而缺血7h和缺血9h的肌組織再灌注后病理變化雖有相似，但程度較弱，肌細(xì)胞水腫加重程度較輕，空泡形成數(shù)量和中性粒細(xì)胞貼壁浸潤數(shù)量也較少(圖1，2)。
三、細(xì)胞凋亡及p53、p21、Bax、Bcl-2的表達(dá)
正常骨骼肌和缺血3h以內(nèi)未檢測到凋亡細(xì)胞，缺血5h再灌注3h，凋亡率顯著升高(X2=3．861，P＜0．01)，缺血7h再灌注3h達(dá)到高峰，凋亡率隨再灌注時間延長而升高，升高幅度較小。凋亡率、p53、p21、Bax的表達(dá)，缺血3h組與5h組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q分別為3．873、3．867、3．914、3．933，P＜0．01)；缺血5h組與7h組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q分別為3．923、3．871、3．848、3．972，P＜0．01)。Bcl-2的表達(dá)隨著時間的延長，明顯下降。各時間點凋亡率及p53、p21，Bax、Bcl-2的表達(dá)見表1(圖3～7)。
討論
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞凋亡的分子機制得到了一定的闡明，先后發(fā)現(xiàn)caspase、Bcl-2、p53等很多基因都與細(xì)胞凋亡有著重要關(guān)系，同時也發(fā)現(xiàn)了多種引導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號引導(dǎo)途徑。對肌組織缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的研究多集中在平滑肌上，對骨骼肌研究報道較少。
有研究表明，再灌注早期骨骼肌細(xì)胞凋亡率明顯升高。骨骼肌的再灌注過程中，從3～9h時都造成了p53和p21 WAF-1的累積增加。許多研究已經(jīng)證明，活化的多形核白細(xì)胞(中性粒)和氧自由基在缺血再灌注過程中的骨骼肌損傷起著重要的作用。再灌注過程中產(chǎn)生的氧自由基能造成DNA損害，激發(fā)由p53和p21 WAF-1介導(dǎo)的一系列細(xì)胞反應(yīng)。p53的增長程度與細(xì)胞對DNA損害的反應(yīng)直接相關(guān)，可以通過p21WAF-1下游因子的增量調(diào)節(jié)來影響細(xì)胞周期停滯和凋亡。一般情況下，細(xì)胞周期停滯是由p21WAF-1的活化來誘導(dǎo)的。從3h到9h，Bcl-2的表達(dá)逐漸下降，當(dāng)p53和p21WAF-1的表達(dá)至高時Bcl-2的表達(dá)降到至低。線粒體損傷也可能是缺血再灌注誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因素。Bcl-2主要分布于線粒體膜上，組成線粒體膜的孔和道，對于維持線粒體的正常功能、控制凋亡因子的外溢有著非常重要的意義。
缺血3～5h，Bax蛋白的水平和細(xì)胞的凋亡率有所增加，但增幅較小。雖然再灌注后p53和p21WAF-1的表達(dá)率逐漸升高，但缺血3h組的p53表達(dá)率高于p2lWAF-1的表達(dá)率。這個結(jié)果可能說明p53可活化p21 WAF-1，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，凋亡是由Bax蛋白的活化來誘導(dǎo)的。我們認(rèn)為，缺血3～5h由p53和P21WAF-1累積來誘導(dǎo)的生長抑制是提供時間以修復(fù)損傷的DNA。此時Bcl-2的表達(dá)還維持在一個較高的水平。表明Bcl-2蛋白可抑制p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Bcl-2還可通過：
①抑制鈣離子的釋放；
②抗氧化劑作用；
③保持線粒體膜的穩(wěn)定性，抑制細(xì)胞色素c和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放。此時Bcl-2/Bax是1．3：1．0。
缺血7h，p53和p21 WAF-1仍在累積，在開始增長時間和高峰時間方面；p21 WAF-1和Bax的變化與p53類似。Bcl-2的表達(dá)下降到較低水平，說明p53活化了Bax蛋白。細(xì)胞凋亡被誘導(dǎo)產(chǎn)生了，此時凋亡率更高。此時Bcl-2/Bax是0．6：1．0。Bcl-2/Bax的比例是決定細(xì)胞生死存亡的變阻器，當(dāng)細(xì)胞接受某些刺激信號后，如果Bcl-2過表達(dá)，形成Bcl-2/Bax異二聚體增加，細(xì)胞免于凋亡；如果Bax高表達(dá)，形成Bax/Bax同二聚體增加，細(xì)胞發(fā)生凋亡。
本研究中p53與p21 WAF-1各時間點表達(dá)接近，說明p21 WAF-1可以以一種非p53誘導(dǎo)的方式活化，p21 WAF-1的活化和細(xì)胞凋亡可以同時發(fā)生，暗示p21 WAF-1與細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡都有關(guān)。Didenko等指出低水平的DNA損傷產(chǎn)生了一個生長停止信號：p21 WAF-1使之修復(fù)損害，高水平的損害觸發(fā)了細(xì)胞凋亡反應(yīng)，即使在那些已經(jīng)誘導(dǎo)活化p21WAF-1的細(xì)胞里也發(fā)生了細(xì)胞凋亡。
組織病理學(xué)研究顯示7h后的損傷遠(yuǎn)比3h時嚴(yán)重，DNA損害也類似。9hp53、p21 WAF-1和Bax的表達(dá)率達(dá)到至高；Bcl-2表達(dá)率至低，凋亡率無明顯增高。這說明7h時，DNA已經(jīng)損害，而且是不可逆的損害，缺血7h前的藥物及手術(shù)是有效的，7h后藥物和手術(shù)可能就無能為力了。對于缺血再灌注損傷更應(yīng)注重早期診斷和早期治療。
本研究結(jié)果顯示大鼠肢體缺血再灌注隨著細(xì)胞凋亡的增加，p53、p21、Bax的表達(dá)明顯上升，Bcl-2的表達(dá)明顯下降，且都在7h時達(dá)到至大，說明p53、p21、Bax、Bcl-2的表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡、缺血再灌注損傷密切相關(guān)，提示針對這些分子的特異治療有可能在某種程度上影響缺血再灌注的進程，這種治療應(yīng)在缺血7h內(nèi)進行。而p53、p21、Bax、Bcl-2的檢測亦有可能作為早期肢體缺血再灌注的參考指標(biāo)。