作者：秦瑞峰顧曉明秦曉春
《第四軍醫(yī)大學學報》2001年01期
【作者單位】：第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院頜面外科!陜西西安710033
第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院頜面外科!陜西西安710033
黑龍江省龍江廣厚醫(yī)院
摘要：
目的：
對骨骼肌分化中的凋亡現象進行初步研究。
方法：
本實驗采用體外培養(yǎng)的C2C12肌母細胞分化模型，用流式細胞儀檢測肌細胞分化過程中細胞周期的變化，提取細胞基因組DNA進行電泳分析，用原位末端標記法進行了凋亡細胞染色，電子顯微鏡觀察凋亡小體的形成。
結果：
C2C12細胞在肌分化誘導24h和48h，檢測出凋亡現象；而對照組、肌分化誘導72h組均未檢出凋亡現象。
結論：
在肌肉分化、發(fā)育的過程中，某些細胞會按自身程序主動死亡，以凋亡細胞的形式排除，而且具有明顯的時間性，終末分化的肌管不易出現凋亡。
0引言
細胞凋亡近年來已成為細胞生物學研究的新領域，它作為一種細胞生理性的死亡方式，在維護機體內環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用。凋亡現象的研究方法很多，形態(tài)上表現為細胞固縮、染色體凝集并向核膜靠攏，終形成新月狀小體；其生化學特征則是DNA在核酸電泳時呈梯級格局。凋亡概念的提出為研究胚胎發(fā)生、發(fā)展、個體形成、器官的細胞平衡增添了新的內容，指導醫(yī)學實踐。骨骼肌肌母細胞分化發(fā)育，先必須退出細胞增殖周期，在多種因子的調節(jié)下，融合成具有多核的肌管結構。C2C12是小鼠骨骼肌肌母細胞，20mL·L-1胚牛血清的DMEM培養(yǎng)基可誘導其分化，且骨骼肌細胞分化過程中DNA的合成以及細胞周期發(fā)生明顯變化。我們采用C2C12細胞模型，對骨骼肌分化中的凋亡現象進行初步研究，以闡述機體骨骼肌發(fā)生、發(fā)育中肌細胞的凋亡作用，從而為進一步研究骨骼肌損傷后再生的調控奠定基礎。
1材料和方法
1.1材料
C2C12細胞（澳大利Proton教授惠贈），調整細胞密度至5×105·L-1，接種于100mL·L-1胚牛血清的DMEM（Hyclone）培養(yǎng)基中，在50mL·L-1 CO2孵育箱培養(yǎng)（37℃）。培養(yǎng)至對數期細胞隨機分為對照組和實驗組，對照組為生長培養(yǎng)基GM（100mL·L-1胚牛血清的DMEM），實驗組改變?yōu)榉只囵B(yǎng)基DM（20mL·L-1胚牛血清的DMEM），分別24、48和72h換為分化培養(yǎng)基的進行實驗。
1.2方法
1.2.1流式細胞儀對細胞的檢測
按文獻，分別取4組細胞試驗，調整細胞數為1×106mL-1，4℃PBS洗滌，700mL·L-1冷乙醇固定，上機前PBS洗滌細胞，加50μg mL-1碘化丙啶，1mL·L-1Triton X-100，0.1mmol·L-1EDTA（Na）2，50μg mL-1Rnase，4℃染色30min樣品300目尼龍膜過濾，488nm氬激光激發(fā)，>610nm濾色片檢測，對細胞進行分析。
1.2.2 TUNEL法
按原位細胞凋亡檢測盒（德國寶靈曼）程序進行。常規(guī)細胞爬片，20μg·mL-1蛋白酶K消化30min，洗3遍，滴加TUNEL反應液，37℃，60min，振洗后加入convert-AP，37℃，60min，之后滴加底物顯色液，10min終止反應，封片，光鏡下分析。凋亡細胞的胞核呈現紫藍色，未凋亡細胞的胞核不著色。
1.2.3電鏡檢測
常規(guī)方法制作透射電鏡標本，用TEM-200EX透射電鏡觀察。
1.2.4 DNA的電泳分析
細胞經2.5g·L-1胰酶消化，800min，離心5min收集細胞，48h漂浮細胞直接從培養(yǎng)液中離心收集。隨之提取各組細胞基因組DNA做電泳分析，在50V，30mA下，用20g·L-1瓊脂糖電泳2h，EB染色30min，紫外燈下觀察、拍照記錄。
2結果
2.1肌細胞分化過程中細胞周期
C2C12肌細胞分化培養(yǎng)基培養(yǎng)48h的細胞周期分析中，可見凋亡峰，在圖中位于單倍體和二倍體峰之間（Fig1）。
2.2形態(tài)學觀察和TUNEL法染色
光鏡下觀察，C2C12肌細胞GM培養(yǎng)24h可見少量凋亡細胞，胞核呈紫藍色，GM誘導48h凋亡細胞數量增多，存活細胞部分開始融合。對照組、GM誘導培養(yǎng)72h組均未見凋亡細胞，后者肌細胞融合形成的肌管增多，肌管內含多個胞核的分化現象（Fig2）。
2.3電鏡觀察
GM誘導培養(yǎng)24h和48h的C2C12肌細胞中，出現凋亡細胞，凋亡細胞核漿比例增大，核片段聚集成塊堆聚在核膜周圍（Fig3）。
2.4細胞基因組DNA的電泳分析
肌細胞于分化培養(yǎng)基培養(yǎng)24h、細胞出現梯狀DNA，尤以48h懸浮細胞顯著（Fig4）。
3討論
迄今已發(fā)現許多因素都可誘導細胞凋亡，生化機制還不十分明確。一般認為程序化細胞死亡過程中核DNA的降解是由于一種Ca2+，Mg2+依賴性內切酶活化引起的。多細胞有機體的發(fā)生、發(fā)育有賴于細胞增殖、分化和死亡的精密結合，即細胞周期的正常運行，細胞的增殖和凋亡的平衡。對肌肉細胞凋亡現象的研究將對揭示肌細胞惡變、老化、退變性肌病等的發(fā)病機制及其治療有重要意義。
FCM是檢測細胞凋亡有效而靈敏的方法，為觀察凋亡提供了新的手段；凋亡細胞檢測技術TUNEL法，是利用凋亡細胞生化特征的先進檢測技術，具有很高的靈敏性。本實驗中肌細胞分化的特定時期即肌母細胞在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)24h和48h，TUNEL法染出了凋亡細胞，此外，DNA凝膠電泳分析出現反映核小體斷裂的DNA梯狀帶。以上結果表明，在肌肉分化、發(fā)育的過程中，某些細胞會按自身程序主動死亡，以凋亡細胞的形式排除，這在肌肉組織重建有積極的意義。另外，凋亡的發(fā)生具有明顯的時間性，分化早期（24h）檢測出凋亡細胞數量較少，可能原因是此期間為特異性基因開放期，分子水平反映活躍，形態(tài)改變不太顯著；分化后期（72h）不再發(fā)生凋亡，主要原因在于誘導72h后肌母細胞已經融合形成肌管，肌管是終末分化的肌細胞，不能再進入細胞分裂周期。不過，近期有的學者SV40大抗原引入肌管，終末分化的肌管重新進入細胞周期，出現減數分裂和凋亡，說明肌管仍具有凋亡發(fā)生的機制。
細胞凋亡時伴有多種基因轉錄和蛋白質合成。c-myc是調控細胞增殖的主要基因，c-myc的表達產物是一種轉錄因子，與細胞增殖分化及癌變有密切關系。Evan等選用大鼠成纖維細胞Rat1/myc為實驗模型研究發(fā)現，當有某些因素（低血清濃度，抑制細胞周期因子，抑癌基因）存在時c-myc基因的表達與細胞程序性死亡密切相關。本實驗在誘導肌細胞分化時采用20mL·L-1血清的DMEM培養(yǎng)基，c-myc可能在細胞的凋亡方面起了很重要作用，c-myc的調節(jié)過程的機制仍很不清楚?？傊?，肌母細胞分化、發(fā)育的過程中出現凋亡現象可能為保證肌肉發(fā)育成熟所必須，為清除不再需要的肌細胞提供了一個有效機制，它的研究對于肌肉系統(tǒng)疾病認識將有很大幫助。