相關(guān)論壇
(北京心肺血管醫(yī)療研究中心，血液流變學(xué)研究室，北京100029)
郭金良李勇孫素琴
(清華大學(xué)化學(xué)系，北京100084)
摘要：
為探明自由基引起紅細(xì)胞流變性改變的作用機(jī)理，我們對(duì)體外自由基作用三十分鐘前后紅細(xì)胞膜剪切彈性模量、細(xì)胞表面指數(shù)、膜脂質(zhì)分子和蛋白分子流動(dòng)性進(jìn)行了比較分析。發(fā)現(xiàn)自由基作用后，紅細(xì)胞膜剪切彈性模量、膜脂質(zhì)分子和蛋白分子的相對(duì)旋轉(zhuǎn)時(shí)間分別增加了百分之49.8、百分之49.5和百分之191.4，而紅細(xì)胞表面指數(shù)無(wú)變化；此外，隨著自由基濃度的降低以上變化也隨之減輕；在自由基損傷后的第三小時(shí)，上述改變部分回復(fù)。本研究說明，自由基引起脂質(zhì)和蛋白分子流動(dòng)性降低共同導(dǎo)致紅細(xì)胞膜剪切彈性模量的增加，并且一定濃度自由基對(duì)紅細(xì)胞流變性的損傷是部分可逆的。
關(guān)鍵詞：自由基；紅細(xì)胞膜剪切彈性模量；膜脂質(zhì)分子流動(dòng)性；膜蛋白分子流動(dòng)性
分類號(hào)：R318.01
0前言
除了神經(jīng)體液調(diào)節(jié)因素和灌注壓外，影響微循環(huán)灌注的主要環(huán)節(jié)還有毛細(xì)血管床的完整及良好的紅細(xì)胞流變性。當(dāng)紅細(xì)胞流經(jīng)內(nèi)徑小于自身的滋養(yǎng)毛細(xì)血管時(shí)需要變形才可通過。已有許多關(guān)于疾病病程中紅細(xì)胞的變形特性被改變的報(bào)道。紅細(xì)胞的硬度不僅受細(xì)胞內(nèi)外多種因素的影響，同時(shí)還取決于細(xì)胞膜的化學(xué)成分(脂質(zhì)和蛋白)及它們的流動(dòng)性。當(dāng)某些物理化學(xué)的、感染或其他的病因引起紅細(xì)胞膜成分、結(jié)構(gòu)和代謝功能變化時(shí)都將影響膜流動(dòng)性進(jìn)而影響整個(gè)細(xì)胞的變形性并由此干擾微循環(huán)灌注。
自由基產(chǎn)生過量或出現(xiàn)在細(xì)胞的某些部位可造成病理學(xué)改變，特別是以氧為核心的自由基已被證明與缺血/再灌注期間的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟的病理改變有關(guān)。缺血/再灌注期間脂質(zhì)過氧化不僅破壞了細(xì)胞膜的完整性，同時(shí)還引起游離脂肪酸釋放進(jìn)而導(dǎo)致了水腫和花生四烯酸代謝等病理學(xué)變化。A.M.Phelan報(bào)道了在腦缺血/再灌注期間，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)流動(dòng)性明顯降低，認(rèn)為與此期間產(chǎn)生的自由基損傷有關(guān)。
但到目前尚未見有關(guān)自由基對(duì)紅細(xì)胞膜分子流變性損傷機(jī)理的研究報(bào)道。為探明自由基對(duì)紅細(xì)胞流變性的作用機(jī)理，本文除觀察了自由基對(duì)離體健康人紅細(xì)胞變形性的影響外，還探討了自由基對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)和蛋白分子流動(dòng)性的作用及其可能的途徑。
1材料和方法
(1)自由基體系
按照下列方法配制高、低濃度的羥自由基體系。高濃度：按1∶1∶1的容積比將3%的H2O2、450μm/L的FeSO4和百分之2.7的NaCl混合制成等滲、pH7.0的羥自由基體系；低濃度：按0.5∶1∶1.5的容積比將百分之3的H2O2、450μm/L的FeSO4和百分之1.8的NaCl混合制成等滲、pH7.0的羥自由基體系。分別在以上體系配制后的即刻、10min、30min和1h用自旋捕捉劑DMPO(5，5-diethyl-1-pyrroline-N-oxide)捕捉自由基，并于室溫下用ESR(electronic spinresonance)-電子自旋共振波譜儀測(cè)定(BRUKERER-200D，微波功率SP=10mW(13db)，調(diào)制幅度MA=5G，放大增益GN=5×104，中心磁場(chǎng)CF=3470G，掃場(chǎng)寬度SW=100G)，證明配制后即刻已產(chǎn)生自由基且在1h內(nèi)其濃度不變。
(2)自由基對(duì)紅細(xì)胞的損傷及恢復(fù)
10名健康成人新鮮紅細(xì)胞(男女各5名)經(jīng)等滲磷酸緩沖液(PBS)清洗兩遍后分別與以上兩自由基體系在室溫條件下作用30min。作用后的紅細(xì)胞經(jīng)PBS清洗兩遍后再于室溫條件下放置3h。
(3)紅細(xì)胞流變參數(shù)測(cè)定
在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采用根據(jù)M.Paulitschke等人的微吸管技術(shù)而設(shè)計(jì)的微管細(xì)胞流變儀對(duì)自由基作用后的10只大鼠紅細(xì)胞流變性變化進(jìn)行的觀察發(fā)現(xiàn)：當(dāng)用內(nèi)徑為1.6～2μm的毛細(xì)管在10cmH2O的負(fù)壓吸引下，每只隨機(jī)測(cè)定8～10個(gè)細(xì)胞，即觀察到紅細(xì)胞膜剪切彈性模量顯著增高(P<0.05)。
本研究中仍采用以上微吸管法，自由基作用前后的每份紅細(xì)胞由內(nèi)徑為1.6～2μm的微吸管在8cmH2O的負(fù)壓下(ΔP)隨機(jī)吸取紅細(xì)胞懸浮液中10～12個(gè)細(xì)胞，并由圖象分析系統(tǒng)計(jì)算出每個(gè)紅細(xì)胞膜的剪切彈性模量、細(xì)胞表面指數(shù)等細(xì)胞流變學(xué)指標(biāo)，分析紅細(xì)胞剛性化程度。圖1所示為微吸管測(cè)定紅細(xì)胞流變性的方法，先后測(cè)量微管內(nèi)半徑RP、紅細(xì)胞被吸入微管內(nèi)部分的長(zhǎng)度L和紅細(xì)胞未被吸入微管部分的直徑D，經(jīng)由計(jì)算機(jī)根據(jù)下列改進(jìn)的M.Paulitschke]經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算紅細(xì)胞膜剪切彈性模量μ、細(xì)胞表面指數(shù)Si。膜剪切彈性模量μ增加和細(xì)胞表面指數(shù)Si下降，分別代表膜流動(dòng)性降低及細(xì)胞相對(duì)體積增大，表明細(xì)胞流變性下降，反之亦然。
上式中K1=2.45，K2=0.63
(4)紅細(xì)胞膜分子流動(dòng)性測(cè)定
將每份經(jīng)PBS清洗兩遍后的兩個(gè)100μl紅細(xì)胞分別再懸浮于500μl的PBS中，其一加入10-3M/L的3-MCP[3-maleimdopropyl(-carbamoyl)-proxyl]8μl充分混勻，標(biāo)記紅細(xì)胞膜蛋白分子；另一加入10-3mol/L的12-DSA(12-doxyl-strearic acid)20μl充分混勻，標(biāo)記紅細(xì)胞膜脂質(zhì)分子區(qū)。室溫標(biāo)記兩小時(shí)后離心去上清。在室溫條件下用電子自旋共振波譜儀(ESR)分別測(cè)定以上標(biāo)記樣品的ESR信號(hào)(除了脂質(zhì)和蛋白分子標(biāo)記物的SW分別為100G和50G外，其他儀器參數(shù)相同，即SP=13db，MA=5G，CF=3470G，GN=5×104)，由于標(biāo)記物分子的相對(duì)旋轉(zhuǎn)時(shí)間反映這些分子運(yùn)動(dòng)時(shí)的周圍分子環(huán)境，因此根據(jù)下式分別計(jì)算膜蛋白(τp)及脂質(zhì)分子(τl)標(biāo)記物的相對(duì)旋轉(zhuǎn)時(shí)間以表示膜蛋白和脂質(zhì)分子流動(dòng)性：
上式中τ為分子相對(duì)旋轉(zhuǎn)時(shí)間，ΔH(0)為ESR譜的中心峰的峰-峰寬，h(1)、h(0)和h(-1)分別為低場(chǎng)峰、中心峰和高場(chǎng)峰的峰高(如圖2所示)。
(5)數(shù)據(jù)分析
用T檢驗(yàn)對(duì)自由基作用后的各實(shí)驗(yàn)參數(shù)與實(shí)驗(yàn)前有關(guān)參數(shù)進(jìn)行醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，設(shè)定P<0.05時(shí)具有顯著性差異，各參數(shù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。
2結(jié)果
表1所示為自由基作用前后紅細(xì)胞膜剪切彈性模量和細(xì)胞表面指數(shù)的比較。無(wú)論與較高濃度或較低濃度自由基作用30min均引起完整紅細(xì)胞膜的剪切彈性模量(μ)明顯增高，增幅分別為百分之49.8和百分之42.7；3h后盡管μ值有所降低，但仍明顯高于作用前。在此期間細(xì)胞表面指數(shù)無(wú)顯著改變。
自由基作用30min后無(wú)論是蛋白或脂質(zhì)的標(biāo)記物分子的相對(duì)旋轉(zhuǎn)時(shí)間都大幅度延長(zhǎng)，表明被標(biāo)記的膜分子有序性增加即流動(dòng)性降低，其中以蛋白的變化較大；3h后，膜分子流動(dòng)性有不同程度的回復(fù)，但是蛋白分子回復(fù)較少，而脂質(zhì)分子流動(dòng)性幾乎回復(fù)到作用前水平(表2)。
本研究中發(fā)現(xiàn)，自由基作用后紅細(xì)胞膜蛋白標(biāo)記物3-MCP的ESR信號(hào)強(qiáng)度增加了數(shù)倍至十?dāng)?shù)倍(表3)，與蛋白流動(dòng)性改變一樣，三小時(shí)后盡管信號(hào)強(qiáng)度有所回復(fù)，但仍較作用前高數(shù)倍。由于3-MCP是與細(xì)胞膜蛋白的巰基(-SH)特異性結(jié)合，因此信號(hào)的增強(qiáng)提示自由基損傷后紅細(xì)胞膜表面暴露的蛋白巰基數(shù)量明顯增加，說明蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，而且這一變化的可逆性較差。
與對(duì)照相比，隨著自由基濃度的降低有關(guān)參數(shù)的變化程度也隨之減輕。
3討論
自由基是自然存在并是許多生理過程所需的含有不配對(duì)電子的活性物質(zhì)。但產(chǎn)生過量或出現(xiàn)在不合適的細(xì)胞部位將會(huì)導(dǎo)致病理學(xué)改變。前期的研究發(fā)現(xiàn)易受自由基攻擊的生物結(jié)構(gòu)是脂雙層。膜磷脂對(duì)氧自由基的攻擊非常敏感的主要原因是：一、其所含的多不飽和脂肪酸的不飽和鍵是自由基攻擊的很好的靶部位，二、分子氧在膜疏水區(qū)的溶解度高于相應(yīng)的親水區(qū)。已證明在生物體中產(chǎn)生的氧衍生出的自由基導(dǎo)致了脂質(zhì)過氧化、炎癥和水腫等組織損傷。缺血/再灌注后膜的完整性的破壞及游離脂肪酸的釋放與脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生相關(guān)，并由此促進(jìn)水腫和花生四烯酸的代謝等病理變化。Bruch等人利用不同的電子順磁脂肪酸氧化氮探針對(duì)人工膜的研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過氧化引起膜內(nèi)部相應(yīng)部位的改變。Anne M.Phelan通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大腦半球缺血/再灌注后只有毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜疏水區(qū)的氮氧自旋標(biāo)記物12-DSA所指示的區(qū)域的微粘度明顯增加，而5-DSA和16-DSA所指示的膜脂質(zhì)分子區(qū)有序性未發(fā)生變化，這與Zaleska等人在脂質(zhì)體被自由基損傷后的發(fā)現(xiàn)一致。
因?yàn)樵谘蹀D(zhuǎn)運(yùn)中大量的氧反復(fù)穿過膜，并且膜含有豐富的非配對(duì)多不飽和脂肪酸，在這些脂肪酸中與C=C烯烴鍵相鄰的亞酰基又易失去氫原子，而紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白又為損傷性自由基的產(chǎn)生提供了氧化還原催化劑——鐵，所以紅細(xì)胞易受到過氧化損傷。當(dāng)紅細(xì)胞膜受到過氧化時(shí)，自由基更易攻擊含四個(gè)或更多烯烴鍵的多不飽和膜磷脂的?；湥@些?；溨饕怯苫ㄉ南┧岷投妓南┧針?gòu)成，過氧化終會(huì)引起這些?；溨邢N鍵的減少。
紅細(xì)胞的流變性受膜流動(dòng)性、胞漿粘度和細(xì)胞體積的影響，其中一個(gè)或幾個(gè)因素發(fā)生變化都會(huì)引起整個(gè)紅細(xì)胞的變形性降低，進(jìn)而影響氧轉(zhuǎn)運(yùn)和微循環(huán)灌注。紅細(xì)胞膜是典型的脂雙層蛋白鑲嵌結(jié)構(gòu)，部分膜蛋白構(gòu)成的細(xì)胞膜骨架不僅起著支撐細(xì)胞膜、維持膜完整性的作用，其自身也可變形；同時(shí)它還起著調(diào)控和限制膜脂分子的運(yùn)動(dòng)空間的作用，因此是膜流動(dòng)性的重要決定因素；其他膜蛋白如一些酶類、一些受體類等等除自身的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)外也發(fā)生膜上的水平運(yùn)動(dòng)。膜脂分子具有旋轉(zhuǎn)、鏈擺動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)等三種運(yùn)動(dòng)方式，無(wú)論何種方式都會(huì)受到分子結(jié)構(gòu)及周圍分子運(yùn)動(dòng)的影響。因此紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性是由膜脂分子和蛋白分子流動(dòng)性及它們彼此相互作用所決定。
本文中自由基作用后紅細(xì)胞膜剪切彈性模量明顯增加而不伴有細(xì)胞指數(shù)的明顯改變說明了自由基引起細(xì)胞膜的剛性化是紅細(xì)胞流變性降低的主要原因；而自由基作用后除12-DSA指示的膜脂質(zhì)分子有序性明顯增加的結(jié)果與上述作者的發(fā)現(xiàn)一致外，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)膜蛋白分子的有序性也明顯增加，其增幅大于脂質(zhì)的變化，說明脂質(zhì)和蛋白分子流變學(xué)的變化共同作用于以上膜剪切彈性模量的改變。如前所述，自由基引起了膜脂質(zhì)過氧化主要表現(xiàn)為磷脂疏水區(qū)酰基鏈中烯烴鍵的減少、分子結(jié)構(gòu)的變化，此外我們的同期研究發(fā)現(xiàn)自由基還引起膜磷脂親水區(qū)中含磷基團(tuán)的磷-氧雙鍵與磷-氧單鍵(P＝O/P-O)的比例異常，這是本文中膜脂分子流動(dòng)性降低的主要原因。有意義的是本文發(fā)現(xiàn)在自由基作用后膜蛋白分子標(biāo)記物信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)和標(biāo)記物的強(qiáng)固定化同時(shí)出現(xiàn)，不僅提示了膜表面蛋白暴露的標(biāo)記位點(diǎn)增加且其中的部分位點(diǎn)是在蛋白分子的內(nèi)部，提示自由基引起了膜表面蛋白楔狀缺損的分子結(jié)構(gòu)變化，這是本文中膜蛋白流動(dòng)性降低的主要分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
至今未曾見到有關(guān)自由基損傷后紅細(xì)胞流變性回復(fù)情況的研究報(bào)道。本文對(duì)自由基損傷后紅細(xì)胞流變性有關(guān)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)觀察表明，三小時(shí)后無(wú)論是細(xì)胞膜的剪切彈性模量或膜脂質(zhì)、蛋白分子流動(dòng)性均有不同程度的回復(fù)，其中脂質(zhì)分子流動(dòng)性幾乎完全回復(fù)到作用前水平；而蛋白分子流動(dòng)性回復(fù)比較小，這與蛋白分子標(biāo)記信號(hào)的回復(fù)情況相似。提示自由基對(duì)紅細(xì)胞流變性的損傷是部分可逆的，這主要是由于膜脂質(zhì)分子流動(dòng)性的回復(fù)，而就紅細(xì)胞流變性不能完全回復(fù)的主要原因是由于自由基損傷導(dǎo)致了蛋白分子結(jié)構(gòu)的重構(gòu)(一旦蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)，其損傷或變化則難以回復(fù))，使蛋白分子與周圍分子的關(guān)系發(fā)生變化從而導(dǎo)致流動(dòng)性不易回復(fù)。從本文中的結(jié)果還可看出自由基對(duì)紅細(xì)胞流變性的損傷程度與自由基濃度有關(guān)。
根據(jù)上述各點(diǎn)我們認(rèn)為，在許多具有產(chǎn)生大量自由基的臨床條件下(如心肌梗塞、腦梗塞、開心手術(shù)期間的缺血/再灌注和炎性過程)，紅細(xì)胞膜上的磷脂和蛋白分子在自由基的攻擊下而發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變，這些變化不僅使分子自身的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)和鏈擺動(dòng)降低，同時(shí)通過改變分子間的關(guān)系而限制周圍分子的運(yùn)動(dòng)，從而降低了完整紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性并終會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞變形性的下降影響循環(huán)及微循環(huán)灌注。
國(guó)家自然科學(xué)基金、北京市自然科學(xué)基金支持項(xiàng)目
1995年5月30日收稿，1995年10月20日修回