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北京生物醫(yī)學(xué)工程2000年第2期第19卷論著
作者：施巖孫大公陳凱謝利德姚偉娟文宗曜
單位：施巖(承德醫(yī)學(xué)院數(shù)學(xué)教研室承德067000)；
孫大公陳凱謝利德姚偉娟文宗曜
(北京醫(yī)科大學(xué)血液流變學(xué)研究中心北京100083)
關(guān)鍵詞：戊二醛；膜蛋白；新激光衍射法；生物力學(xué)特性
摘要
本文通過(guò)不同濃度戊二醛作用于紅細(xì)胞膜。用新型激光衍射法測(cè)量了這些紅細(xì)胞樣品的彈性模量E和膜粘度μm。同時(shí)通過(guò)DPH標(biāo)記的螢光偏振法測(cè)定了這些紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性，并采用MSL標(biāo)記的電子自旋共振波譜技術(shù)(ESR)測(cè)量了紅細(xì)胞膜蛋白運(yùn)動(dòng)性的變化，并取得了與新型激光衍射法一致的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)膜蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，膜脂流動(dòng)性下降，紅細(xì)胞膜剪切彈性模量(E)和表面粘度(μm)均呈上升趨勢(shì)，紅細(xì)胞變形能力下降。并對(duì)上述紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變所引起的微觀(guān)流變特性的變化進(jìn)行了初步探討。
0前言
紅細(xì)胞膜的力學(xué)性質(zhì)主要由膜骨架的結(jié)構(gòu)決定，如果構(gòu)成膜骨架的各種蛋白相互之間的作用異?；蚰撤N蛋白有缺陷均可引起紅細(xì)胞膜力學(xué)性質(zhì)的改變，從而引發(fā)多種疾病。如遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥(HS)、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)等都是由于膜蛋白的缺陷或異常引起的。日本學(xué)者M(jìn)anno等人研究了骨架蛋白磷酸化和完整細(xì)胞膜的功能之間的關(guān)系，他們認(rèn)為細(xì)胞膜力學(xué)穩(wěn)定性受膜酪蛋白激酶I對(duì)beta-spectrin的磷酸化調(diào)控，beta-spectrin的磷酸化降低增加了細(xì)胞膜的力學(xué)穩(wěn)定性；反之磷酸化程度的增加降低了細(xì)胞膜的力學(xué)穩(wěn)定性。An XL和Takakuwa等人研究了紅細(xì)胞膜蛋白4.1和帶3蛋白相互作用對(duì)膜力學(xué)性質(zhì)的影響，他們發(fā)現(xiàn)隨著蛋白4.1與帶3蛋白的分離，帶3蛋白與錨蛋白的相互作用增強(qiáng)，使細(xì)胞膜的變形性下降，機(jī)械穩(wěn)定性增加。Gwozdzinski等人利用電子共順磁共振技術(shù)研究了慢性腎衰竭病人的紅細(xì)胞膜性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)慢性腎衰竭病人的紅細(xì)胞的滲透脆性比正常人有顯著增加，而且膜蛋白的運(yùn)動(dòng)性下降。即便在正常生理過(guò)程中隨紅細(xì)胞的衰老，紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)也在不斷發(fā)生變化，導(dǎo)致紅細(xì)胞剛性增加，終會(huì)被從血液循環(huán)系統(tǒng)中清除掉。我們?cè)群笱芯苛巳辫F性貧血大分子吸附，白蛋白對(duì)紅細(xì)胞微觀(guān)流變特性的影響及胰蛋白酶對(duì)紅細(xì)胞膜的水解作用。本文通過(guò)戊二醛作用于紅細(xì)胞膜，通過(guò)DPH標(biāo)記的螢光偏振法測(cè)定了這些紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性，采用MSL標(biāo)記的電子自旋共振波譜技術(shù)(ESR)測(cè)量了紅細(xì)胞膜蛋白的構(gòu)象的動(dòng)態(tài)變化，并用新型激光衍射法測(cè)量了這些紅細(xì)胞樣品的彈性模量E和膜粘度μm。獲得對(duì)紅細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的定量描述。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器
北京大白兔，由北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部供給；戊二醛(Glutaraldehyde)；馬來(lái)酰亞胺(MSL，Sigma公司)；DPH(NULL，6-二苯基1，3，5-乙三烯，Sigma公司)；聚乙烯吡咯烷酮PVP(polyvinlpyrolidone，分子量為30kD)。
BrukerESP300型電子自旋共振波譜儀；日立(HITACHI)850型熒光分光光度計(jì)；GYJ-I型自動(dòng)激光衍射，北京醫(yī)科大學(xué)與北京地質(zhì)儀器廠(chǎng)聯(lián)合研制；低溫高速離心機(jī)LG10-3A北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)
1.2方法與步驟
1.2.1紅細(xì)胞膜(resealed ghost)制備
大白兔頸動(dòng)脈插管取血，肝素抗凝，離心去血漿及白細(xì)胞，加入等滲PBS離心，去上清，重復(fù)2次，得紅細(xì)胞。將pH7.9的低滲緩沖液在4℃左右按40∶1的體積加入紅細(xì)胞中，使之溶血，用高速冷凍離心機(jī)在12000rpm下離心，棄上清，如此重復(fù)4次，得白色細(xì)胞膜放入pH7.4的等滲PBS中使之封閉。
1.2.2用電子自旋共振波譜技術(shù)(ESR)測(cè)量經(jīng)戊二醛處理、馬來(lái)酰亞胺(MSL)標(biāo)記的紅細(xì)胞膜蛋白構(gòu)象及運(yùn)動(dòng)性的變化。
取細(xì)胞膜5份，每份200μl，分別用濃度為0、1/4000、1/3000、1/2000、1/1000(V/V)的戊二醛PBS緩沖液懸浮5min，然后立刻離心去上清，再用等滲PBS離心洗滌三次，以終止反應(yīng)。
將15μl的馬來(lái)酰亞胺(MSL)溶于800μl的PBS后加入各份樣品中進(jìn)行標(biāo)記，在冰水中攪拌4min，置于4℃冰箱過(guò)夜。上機(jī)測(cè)試前用PBS洗滌膜3～4次(10000rpm，10min)。
1.2.3用熒光偏振法測(cè)定經(jīng)戊二醛處理的紅細(xì)胞膜脂流動(dòng)性
用濃度為0、1/4000、1/3000、1/2000、1/1000和1/500的戊二醛處理細(xì)胞膜5min，然后迅速離心清洗終止反應(yīng)。每份樣品含400μg蛋白。
用熒光探劑DPH標(biāo)記紅細(xì)胞膜及上機(jī)測(cè)量熒光偏振度(P)。
1.2.4用新型激光衍射法測(cè)定經(jīng)戊二醛處理的紅細(xì)胞在C=0軌道上的小變形(DId)
兔耳緣取血，離心后去血漿及白細(xì)胞等，然后用等滲PBS離心清洗得純凈的紅細(xì)胞。
用戊二醛濃度分別為0、1/4000、1/3000、1/2000、1/1000的PBS緩沖液懸浮紅細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml，處理5min后迅速離心終止反應(yīng)。
測(cè)量紅細(xì)胞平均直徑。
將處理過(guò)的紅細(xì)胞分別用百分之3的PVP溶液(分子量30kD，其中含百分之0.04的牛血清白蛋白)懸浮，用新型激光衍射法測(cè)量紅細(xì)胞在C=0軌道上的小變形(DId)，測(cè)試條件為：剪切率=200s-1。
1.2.5用傳統(tǒng)激光衍射法測(cè)定經(jīng)戊二醛處理的紅細(xì)胞在高粘流場(chǎng)中大的變形指數(shù)(DImax)及變形恢復(fù)半衰減時(shí)間(t0.5)。
紅細(xì)胞準(zhǔn)備同(1.2.4)。
用戊二醛處理紅細(xì)胞同(1.2.4)。
經(jīng)戊二醛處理后的紅細(xì)胞用百分之15PVP懸浮，紅細(xì)胞濃度仍為2×107個(gè)/ml，用激光衍射法測(cè)量(i)紅細(xì)胞較大變形指數(shù)(DImax)；(ii)紅細(xì)胞變形恢復(fù)半衰減時(shí)間(t0.5)，測(cè)量條件為：較大切變率為1000s-1。
2結(jié)果與討論
經(jīng)戊二醛處理后，紅細(xì)胞膜的電子自旋共振譜的蛋白強(qiáng)弱固定比(S/W)結(jié)果如圖1所示。由圖可以看出，S/W值隨戊二醛濃度的增加而顯著增大，表明經(jīng)戊二醛作用后，紅細(xì)胞膜蛋白運(yùn)動(dòng)性下降。戊二醛是一種常用的同型雙功能交聯(lián)劑，它的兩個(gè)醛基可以與兩個(gè)相同或不同分子上的伯氨基形成Schiff氏堿，將兩分子以五碳鏈的橋聯(lián)接起來(lái)。經(jīng)戊二醛處理后，紅細(xì)胞膜蛋白產(chǎn)生不同程度的交聯(lián)，這種交聯(lián)作用對(duì)紅細(xì)胞膜上的蛋白空間取向、彼此間的相互作用勢(shì)必產(chǎn)生影響。由于橋聯(lián)的作用膜蛋白彼此間的約束加強(qiáng)，膜蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)趨于收縮。
采用熒光偏振技術(shù)測(cè)量的經(jīng)戊二醛處理后的紅細(xì)胞膜的熒光偏振度(P)，隨戊二醛的劑量增加而上升，結(jié)果如圖2，說(shuō)明脂流動(dòng)性下降。由于膜蛋白與膜脂的相互作用，膜蛋白產(chǎn)生不同程度的交聯(lián)后進(jìn)而影響了膜脂的流動(dòng)性。隨交聯(lián)程度的增加對(duì)膜脂的流動(dòng)性影響越大，然而比較圖1和圖2，可以看到，S/W值的變化趨勢(shì)與P值的變化趨勢(shì)是不同的，說(shuō)明膜蛋白的變化對(duì)膜脂流動(dòng)性的影響是非線(xiàn)性的。
利用文宗曜等人提出的新型激光衍射法，我們測(cè)定了經(jīng)不同濃度戊二醛處理的紅細(xì)胞在低粘低切變(η=3cp，γ=200s-1)流場(chǎng)中C=0軌道上的小變形DId，結(jié)果見(jiàn)表1。同時(shí)測(cè)量了經(jīng)不同濃度戊二醛處理后的兔紅細(xì)胞直徑，平均值為6.5±0.5μm。
利用施巖等人提出的公式：
分別代入不同戊二醛濃度下的小變形值DId以及紅細(xì)胞平均半徑，計(jì)算出不同戊二醛濃度下紅細(xì)胞的剪切彈性模量(E)，結(jié)果如圖3。
利用傳統(tǒng)激光衍射法我們分別測(cè)得不同戊二醛濃度下的紅細(xì)胞變形恢復(fù)半衰減時(shí)間t0.5，及紅細(xì)胞大的變形指數(shù)DImax，結(jié)果見(jiàn)表1。
根據(jù)施巖等人提出的公式：
將已獲得的E和t0.5代入上式，即可求得不同濃度戊二醛作用下紅細(xì)胞膜粘度(μm)，結(jié)果見(jiàn)圖4。
由圖3、4的結(jié)果可知，隨著膜蛋白交聯(lián)程度的增加，導(dǎo)致膜剪切彈性模量(E)上升，即紅細(xì)胞膜剛性程度上升，紅細(xì)胞粘度(μm)也明顯上升。膜剪切彈性模量(E)和膜粘度(μm)主要由紅細(xì)胞膜蛋白的性質(zhì)決定，利用傳統(tǒng)激光衍射法只能獲得紅細(xì)胞變形性的相對(duì)量DImax，而用新型激光衍射法我們獲得了描述紅細(xì)胞微觀(guān)力學(xué)性質(zhì)的物理量，說(shuō)明新型激光衍射法在研究紅細(xì)胞微觀(guān)力學(xué)性質(zhì)上比利用傳統(tǒng)激光衍射法更為優(yōu)越。E和μm的增加導(dǎo)致了紅細(xì)胞變形能力的下降。
綜上所述，戊二醛作用于紅細(xì)胞膜后造成膜蛋白交聯(lián)，蛋白間結(jié)合位點(diǎn)增多導(dǎo)致膜蛋白運(yùn)動(dòng)性下降，構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)趨于收縮；在膜蛋白交聯(lián)作用的影響下膜脂流動(dòng)性降低；紅細(xì)胞膜剪切彈性模量(E)和表面粘度(μm)均呈上升趨勢(shì)，紅細(xì)胞剛性增加，紅細(xì)胞變形能力下降。用新型激光衍射法測(cè)得的膜剪切彈性模量(E)和表面粘度(μm)，很好地證明了戊二醛作用于紅細(xì)胞膜蛋白使之交聯(lián)而產(chǎn)生的膜蛋白構(gòu)象的改變。
作者簡(jiǎn)介：孫大公(1966-)，男，北京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)物理教研室講師。