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高美霞吳敏慧紀云鵬蔡莉王泰瑞楊瑩梁文飚
【作者單位】：江蘇省血液中心；
《中國醫(yī)藥指南》2011年13期
【摘要】：
目的：
研究全血紅細胞胞外pH環(huán)境對紅細胞膜流動性和膜蛋白的影響。
方法：
將全血紅細胞懸浮在不同pH值的ACD-B保養(yǎng)液中，分別在4、8和24h，利用熒光探針1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)和SDS-PAGE電泳檢測紅細胞膜流動性及紅細胞膜蛋白；利用透射電鏡觀察紅細胞形態(tài)；利用比色法檢測紅細胞上清中游離血紅蛋白(FHb)。
結(jié)果：
除了環(huán)境pH在6.8的實驗組外，其余各組的紅細胞的偏振度、微黏度、Band3蛋白、紅細胞形態(tài)和FHb與正常對照組存在差異性顯著。
結(jié)論：
全血pH環(huán)境可影響紅細胞膜流動性和膜蛋白的表達，可對紅細胞的功能產(chǎn)生影響。
紅細胞懸液由全血制備而來，是目前臨床輸血中使用多的紅細胞類血液制劑。本研究探討了全血紅細胞用于MAP紅懸液制備前，其細胞外pH和作用時間對紅細胞膜流動性、膜蛋白和形態(tài)的影響，為探討某些特殊情況的血液(如不足量血)制備紅細胞懸液的應(yīng)用潛能提供依據(jù)。
1材料與方法
1．1儀器及試劑
HITACHI KY2000型半自動生化分析儀、JEM-1010透射電鏡、島津RF-540型熒光分光光度計、NanoDropND-1000微量紫外可見分光光度計、Bio-Rad電泳儀及QuantityOne分析軟件；ACD-B全血保養(yǎng)液為山東威高公司產(chǎn)品，1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(diphenyl-hexatriene，DPH)為Sigma公司產(chǎn)品，標準分子量蛋白由MBI公司生產(chǎn)，游離血紅蛋白測定試劑由南京生物建成公司提供。
1．2方法
1．2．1紅細胞在不同pH值環(huán)境的處理
取常規(guī)的ACD-B全血保養(yǎng)液，通過緩慢滴加0．1mol/LNaOH制備成不同pH值(pH分別為5．0、5．6、6．2、6．8和7．4)的全血保養(yǎng)液。隨機選擇6名知情同意的相同血型健康獻血者、分別采集5mL肝素抗凝全血；立即將6份同型全血混合以減少個體差異，4℃條件下以等滲PBS(pH7．4)緩沖液，2000g離心10min，洗滌3次，稱重壓積紅細胞，將洗滌紅細胞均分6份，1份為對照，5份按紅細胞和全血保養(yǎng)液的體積比為4：6的比例，懸浮在不同pH值的ACD-B全血保養(yǎng)液中，分別處理4h、8h和24h后。
1．2．2紅細胞膜樣品的制備
低滲溶血法制備紅細胞膜，實驗組和對照組分別取0．5mL壓積紅細胞，PBS反復(fù)洗滌3次，用0．01mol/L tris-Hcl溶血破膜；然后以10000r/min離心15min，反復(fù)洗滌3次后的乳白色提取物即為紅細胞膜樣品，所有操作均在4℃條件下進行，ND-1000微量紫外可見分光光度計測定紅細胞膜蛋白濃度。
1．2．3紅細胞膜蛋白SDS-PAGE電泳
測定紅細胞膜蛋白濃度，取20ug蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，QuantityOne軟件分析紅細胞膜蛋白的組成。
1．2．4紅細胞膜流動性的檢測
采用文獻方法。采用熒光偏振法檢測熒光偏振度并計算出紅細胞膜的微黏度。用四氫呋喃作溶劑配制2×10-3mol/L的熒光探針DPH儲存液，于棕色瓶中4℃保存。臨用前用等滲PBS稀釋為2×10-6mol/L的工作液，取2mL紅細胞膜蛋白(蛋白濃度0．03g/L)，加入2mL DPH工作液，37℃溫育30min，用熒光分光光度計，測定其熒光偏振度P(激光波長362nm，發(fā)射波長432nm激發(fā)狹縫10nm，發(fā)射狹縫10nm)。利用P與微黏度(η)的定量關(guān)系計算出紅細胞膜的微黏度。
其中I-vv為起偏器與檢偏器光軸均在垂直方向時的熒光強度，I-VH為起偏器光軸在垂直方向，檢偏器光軸在水平方向時的熒光強度I-vv為二者光軸均在水平方向的熒光強度，I-HV為起偏器光軸在水平方向、檢偏器光軸在垂直方向的熒光強度，G為校正因子，G=（I-HV）/（I-HH）。
1．2．5上清FHb濃度的測定
分別在4h、8h和24h檢測實驗組和對照組上清中FHb濃度。
1．2．6紅細胞膜形態(tài)的觀察
取1mm見方的紅細胞團塊，用2．5％戊二醛和1％鋨酸固定后，經(jīng)脫干、墊入、分割、染色，置于電鏡下觀察、拍片記錄。
1．2．7統(tǒng)計學(xué)處理
數(shù)據(jù)采用SPSS15．0進行重復(fù)測量數(shù)據(jù)分析。
2結(jié)果
2．1不同pH值處理后，紅細胞膜熒光偏振度、微黏度和紅細胞上清中FHb濃度見圖1～3。
圖1中，0h與4h和0h與8h處理組中，除pH=6．8組外，各組的熒光偏振度有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)；0h與24h處理組中，各組的熒光偏振度均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)；4h與8h處理組中，除pH為5．0和5．6組外各組的熒光偏振度有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)；4h與24h處理組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)；8h與24h處理組中除pH為5．0和5．6組外均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)。
圖2中，0h與4h和0h與8h處理組中，除pH=6．8組外，各組的紅細胞膜微黏度均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)；0h與24h處理組中，各組的紅細胞膜微黏度有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)；4h與8h處理組中，除pH為5．0和5．6組外各組的紅細胞膜微黏度有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)；4h與24h處理組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)；8h與24h處理組中除pH為5．0和5．6組外均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)。
圖3中，0h與4h、0h與8h、0h與24h、4h與8h、4h與24h和8h與24h處理組中，除pH=6．8組外，各組的游離血紅蛋白有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)。
2．2紅細胞膜蛋白SDS-PAGE電泳分析
見圖4。
圖4中，C為正常對照組，1和2為分別在pH 5．0保養(yǎng)液中處理8h和4h的實驗組；3和4為分別在pH 6．2保養(yǎng)液中處理8h和4h的實驗組；5和6為分別在pH6．8保養(yǎng)液中處理8h和4h的實驗組。
2．3全血紅細胞胞外pH環(huán)境對細胞膜形態(tài)學(xué)的影響
顯微鏡下觀察的正常紅細胞，表面光滑，邊緣整齊。當紅細胞胞外pH<6．8后，紅細胞膜形態(tài)發(fā)生改變，大部分表面棘狀突起有伸出，并伴隨有細胞的聚集，見圖5。
3討論
紅細胞周圍環(huán)境pH值的變化可影響脂雙層的穩(wěn)定性和磷脂在細胞膜上的分布，可改變細胞膜的力學(xué)特性、細胞形態(tài)大小以及細胞內(nèi)Hb分子的結(jié)構(gòu)與濃度而影響紅細胞的功能和存活。研究證實，紅細胞胞外酸堿度與細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、膜的變形能力和流動特性以及血紅蛋白的攜氧能力相互密切關(guān)聯(lián)；Gedde報道紅細胞在胞外pH值低于6．3時，紅細胞膜曲率為負數(shù)，可對胞膜的力學(xué)特性及細胞形態(tài)產(chǎn)生影響。DPH被認為是一種比較敏感的熒光探針，通過測定反映膜脂區(qū)域微黏度的熒光偏振度，可了解膜脂的流動性。我們利用DPH研究了不同pH值保養(yǎng)液和儲存時間對紅細胞熒光偏振度的影響，實驗結(jié)果表明，盡管沒有任何標本發(fā)生肉眼可見的溶血，但pH在5．0～5．6范圍內(nèi)，紅細胞的偏振度和微黏度顯著上升，流動性變小；紅細胞分別在pH6．2～pH7．4的保養(yǎng)液中，其偏振度和微黏度的變化基本相同；只有在pH6．8的保養(yǎng)液中，紅細胞才具有與正常對照組相同的偏振度和微黏度以及較好的流動性。
紅細胞正常形態(tài)的維持依賴于細胞膜及膜骨架的支持，因此細胞形態(tài)可以反映細胞膜的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的變化。當紅細胞經(jīng)不同pH值環(huán)境和儲存時間處理后，部分紅細胞發(fā)生棘突和形態(tài)改變，聚集程度增加，而膜上的自聚集作用可能導(dǎo)致膜融合和形成非專一性離子通道，從而破壞細胞膜結(jié)構(gòu)。另外，紅細胞膜流動性的降低，也可造成細胞膜的損害甚至溶血。紅細胞在不同pH值保養(yǎng)液中的儲存時間對其微黏度和流動性的影響是顯著的，通過研究與紅細胞膜的彈性特性相關(guān)的內(nèi)在性膜蛋白Band3的表達，我們發(fā)現(xiàn)在低于pH6．8的儲存環(huán)境中，Band3的表達量隨著環(huán)境pH的降低和儲存時間的延長而顯著減少；而在pH 6．8的保養(yǎng)液中，Band3在4h內(nèi)的表達量與正常對照組基本相同。Band3為多次跨膜蛋白，具有陰離子轉(zhuǎn)運功能，Band3和血型糖蛋白分別通過Band 2．1和Band4．1與收縮蛋白結(jié)合，使骨架網(wǎng)絡(luò)附著于膜脂雙層上形成膜骨架，低pH環(huán)境和保存時間的延長，導(dǎo)致Band3蛋白數(shù)量減少或被氧化、降解，與其他蛋白或自身交聯(lián)、構(gòu)型改變，骨架蛋白失去與膜內(nèi)表面的連接，紅細胞膜上的脂蛋白及脂質(zhì)逐漸喪失，使紅細胞膜的微黏度升高，膜流動性降低，紅細胞逐漸變形，脆性增加。因此，初步的研究結(jié)果表明，盡早將紅細胞從異常pH環(huán)境中分離出來，對于保證紅細胞的結(jié)構(gòu)和功能是非常必要的。
目前國內(nèi)外采供血機構(gòu)普遍使用ACD(pH 5．03)，CPD(pH5．60)和CPDA(pH 5．60)保養(yǎng)液采集全血，由于不足量血的紅細胞與保養(yǎng)液的比例失調(diào)，導(dǎo)致紅細胞的胞外pH值低于正常標準，進而影響紅細胞的能量代謝和生理功能。本研究的意義在于為進一步探討不足量血紅細胞的百分比含量以及全血分離時間與紅細胞懸液質(zhì)量的關(guān)系，為不足量血潛在的綜合利用提供依據(jù)，不僅可進一步節(jié)約寶貴的血液資源，也體現(xiàn)了對無償獻血者的尊重，在目前血液供應(yīng)緊張的情況下，不失為一種開源節(jié)流、合理用血的應(yīng)對策略之一。